鲟鱼发酵过程中微生物的演替变化分析

赵 凤， 李小义， 张效平， 杨 兴， 蒋晓红

(贵州省农业科学研究院 水产研究所， 贵州 贵阳 550025)

传统的发酵鱼是将鲜鱼处理后，整条或切块、腌渍、风干，配上辅料，自然条件下密封发酵而成。这样制作的腌鱼具有保质期长、蛋白质含量高、脂肪含量低、游离氨基酸种类多等特点。贵州黔东南苗族、侗族自治州的腌鱼做法是，以稻田养殖的鲤鱼为原料，剖开鱼体，除去内脏，腌制24 h左右，拌入糯米饭、香辛料、辣椒等辅料，层鱼层辅料入坛，自然条件下避光发酵。腌鱼味道鲜美、口感软嫩，可以直接食用，也可以蒸、炸，是当地居民招待客人的美味佳肴。在国外，如日本、东南亚和非洲等地也有发酵鱼产品的制作和食用习惯[1-3]。

由于发酵鱼是在自然条件下发酵，环境条件、发酵鱼种类、地区差异等导致产品中的微生物种群分布、菌落演替、结构组成等各不相同[4]；而不同种类的微生物对产品的安全、感官、色泽、质构、风味等有主要影响，所以研究发酵鱼产品中微生物群落结构可以调控和提升产品的质量。目前，国内主要应用传统培养方法和生理生化实验手段对发酵鱼制品中的微生物进行研究[5-6]，但是这种传统的培养方法有很大的局限性，比如分离的微生物不全面[7]，不能很好地展示产品中的菌相情况。高通量测序技术可以准确快速地获得大量的测序数据[8-9]，此方法具有对微生物不需要分离培养，可以检测丰度很低的微生物，准确而全面地展示样品中的微生物群落情况等特点，被广大研究者应用在发酵食品中[10-12]。

目前，在食品发酵研究中，韩国学者利用高通量测序技术对海鲜酱、鱼酱和泡菜[13-15]等的发酵微生物多样性进行了解析，国内学者也利用此技术对腌干鱼加工过程的微生物群落[16]和不同发酵工艺条件下微生物多样性[17]进行了分析，但是关于鲟鱼发酵过程中微生物的演替规律和多样性分析还未见报道。本实验以传统发酵鲟鱼为研究对象，拟采用溴化十六烷三甲基铵(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取总细菌DNA，基于Illumina HiSeq高通量测序平台，利用双末端测序(paired-end)的方法，对16S rDNA V4～V5区进行测序；希望获得发酵鱼制品中细菌数量和结构数据，揭示样品微生物物种构成以及不同发酵阶段样品之间的差异关系，旨在为传统发酵鲟鱼的制作者调控发酵环境和发酵工艺提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

新鲜鲟鱼，由贵州省水产研究所惠水养殖基地提供。

操作要点：取鲜活的鲟鱼宰杀，去头、去尾、去内脏，取肉沥干。将鱼片切成每块重20～30 g，添加鱼块重量3%的食盐和各种香辛料(辣椒、花椒、姜等)，搅拌均匀，在4 ℃条件下腌制2 d；在50～60 ℃的条件下干燥3 h，干燥至水分含量约55%～60%，冷却至室温；在容器底部铺上部分糯米粉，按一层鱼一层糯米粉，压紧，顶部铺上一层糯米粉后夯实，加盖、封严。20～24 ℃，对装满坛子的鱼肉发酵5～6周，直至pH值达到4.1～4.4，制得即食休闲风味发酵鱼制品。

样品采集：采集新鲜、腌制、发酵5，10，20，25 d和35 d 7个时期的鲟鱼发酵样品(编号分别为CX、CTA、CTB、TCC、CTD、CTE、CTF)，每个时期取3个样品作为平行实验。

1.2 实验方法

1.2.1DNA的提取与检测

取样品10 g，加入100 mL灭菌生理盐水中，均质拍打2 min 后，至4 ℃摇床震荡30 min， 静置10 min，取上清液离心，弃上清液备用。采用CTAB法对DNA进行提取。分别使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳判断DNA样品的浓度和纯度。

1.2.2PCR扩增及高通量测序

扩增的目标区域是16S rDNA基因的V4～V5区域，引物序列515F：GTGCCAGCMGCCGCGG，907R：CCGTCAATTCMTTTRAGTTT[18]。PCR反应20 μL体系：10 μL 5×Primes STAR Buffer，1 μL DNA 模板，1 μL each primer (0.1 mol/L), 0.5 μL Primes STAR HS DNA polymerase。PCR 反应程序：98 ℃预变性1 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27个循环，72 ℃完全延伸5 min。扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检查扩增效果。每个时间点采集3个平行样品，样品的PCR产物，送至广州赛哲生物科技股份有限公司，在Illumina HiSeq平台上进行高通量测序。

1.3 数据处理

为获得更为精准、高质量的生物学信息，需要对数据进行质量控制。采用 Mothur 软件将得到的16S rDNA基因序列在RDP(ribosomal database project)数据库中进行嵌合体检验，充分去除嵌合体序列。为了得到每个操作分类单元(OTU)对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，用Mothur软件构建稀释性曲线，利用QIIME软件分析Alpha多样性(Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数和ACE指数)。用非加权组平均法构建树状结构，用于微生物群落相似度分析。

2 结果与分析

2.1 鲟鱼发酵样品的微生物Alpha多样性分析

利用稀释曲线来评价测序量是否覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富度。通过OTU相对比例和数量的期望值绘制稀释曲线，见图1。图1中曲线趋势比较平缓，说明本次测序深度已基本覆盖样品中的所有物种，且能很好地体现样品细菌的多样性和分布，测序结果可代表鲟鱼发酵样品中细菌群落的真实情况。

图1 OTU稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve of OTU

不同发酵阶段的各个样品的多样性指数如表1。对测序进行拼接、过滤，得到有效序列，7个不同发酵阶段的鲟鱼样品平均获得46 463条序列。将相似度97%的序列聚类为OTUs，其中CX、CTA、CTB、CTC、CTD、CTE和CTF各组的平均OTU数量分别为1 064、952、454、442、327、372和356。从表1中可以看出，起始阶段细菌菌群的丰富度和多样性明显高于其他样本，说明原料和发酵开始时细菌种类最为丰富，这些微生物可能来源于肉和腌制料中；一旦发酵启动，细菌菌群的丰富度和多样性迅速下降，说明大多数外源微生物因不能适应环境，消失或生长暂时受到抑制。

2.2 鲟鱼不同发酵时期的物种注释

通过高通量测序得到7组不同发酵阶段的鲟鱼样品在门水平上，共38门。门水平上鲟鱼发酵样品的菌群变化如图2。从图2中可以看出，细菌群落中门水平平均含量大于1%的是放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。Proteobacteria的相对含量从新鲜鲟鱼到发酵成熟逐渐降低；Firmicutes在腌制样品中相对含量很低，但是发酵过程及结束时，丰度越来越大，成为优势菌属。菌落变化主要原因可能是，随着发酵时间延长，pH值降低，抑制了大量微生物繁殖，仅有少量适应酸性环境的微生物生长。Firmicutes中很多蓝藻细菌可以产生内生孢子，孢子可以抵抗恶劣环境，所以在发酵中后期，Firmicutes的丰度最大[19]。蓝藻门、拟杆菌门仅在鲟鱼新鲜和腌制两个阶段检测到，其他阶段基本没有。

使用平台测序数据库进行物种注释，得到7组不同发酵阶段鲟鱼样品在科水平上共196科。科水平上鲟鱼发酵样品菌群变化如图3。从图3中可以看出，细菌群落中门水平平均含量大于1%的是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、 明串珠菌科(Leuconostocaceae)、 莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、 葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和 链球菌科(Streptococceae) 。在整个发酵过程中葡萄球菌科(Staphylococcaceae)的相对含量先增高后降低，乳杆菌科(Lactobacillaceae)的相对含量逐渐升高。

表1 各样品的生物群落丰富度和多样性指数

Chao1 指数和 Shannon 指数值越高，说明群落物种的丰富度越高；Simpson 指数反映样品的多样性程度，Simpson值越大说明样品群落多样性越低。

图2 门水平上鲟鱼发酵样品细菌群落变化Fig.2 Changes in bacterial community in sturgeon during fermentation at phylum level

图3 科水平上鲟鱼发酵样品细菌群落变化Fig.3 Changes in bacterial community in sturgeon during fermentation at family level

热图可以用来表示在属的水平上各样本物种的相对丰度。使用丰度表格进行丰度聚类热图的绘制，计算距离的方式是欧氏距离，聚类方式是用了最长距离法。对热图进行column标准化，图4为鲟鱼发酵各样品的聚类热图。

图4 各样本在属水平的热图Fig.4 Heatmap of all samples at genus level

对鲟鱼发酵样本进行样品聚类和物种聚类分析(热图上侧是样本的聚类树，左侧是OTU的聚类树)。图4中，横坐标是样本，纵坐标是物种，颜色从蓝到红丰度越来越高。从图中可以看出，大部分物种的相对丰度都比较低，只有少部分物种的相对丰度较高。在CX阶段菌属丰度大于1%的主要优势菌属是葡萄球菌属(Staphylococcus)，CTA阶段属丰度大部分小于1%，发酵初期CTB阶段菌属丰度大于1%的主要优势菌属是葡萄球菌属(Staphylococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactobacillus)；发酵中期至结束，菌属丰度大于1%的主要优势菌属是明串珠菌属(Leuconostos)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Enterococcus)。乳酸菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属等是水产品加工和保藏的优势菌属，如李改燕[20]研究的糟鱼发酵过程中的优势菌属为芽孢杆菌属、葡萄球菌、乳酸菌和酵母菌；Kuda等[21]研究的日本发酵鱼制品中的优势菌属是乳酸菌和乳酸球菌属；而本实验结表明，葡萄球菌、明串菌属、乳球菌属、乳杆菌属和乳酸球菌属为整个发酵过程中的优势菌属。这些研究结果的差异可能与发酵的产品组成和发酵参数的影响有关。乳酸球菌属具有良好的生物安全性和益生特性，常作为益生菌而被应用到发酵食品中[22]，本研究中，乳酸球菌在发酵的开始到结束一直保持着较高的丰度，与前者的研究结果类似。

2.3 鲟鱼发酵不同阶段样品中细菌群落的比较

为比较发酵过程中每组样本的细菌群落相似性，采用最长距离法对样品进行聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)，样本间的距离越小说明样本间的细菌群落越相似。

图5 各组样品的聚类分析和主成分分析Fig.5 HCA and PCA analysis of different groups

图5为发酵样品的聚类分析和主成分分析结果。从聚类分析结果可以看出，整个发酵过程中每个阶段的细菌群落结构有较大差异，并且CX与其他样本的细菌群落分别位于两个不同的分支。PCA分析结果的二维主成分图展示了各样品在第一和第二主成分上面的投影，样品间距离越远表示样品的物种组成差异越大[23]。通常，当第一主成分解释程度高于80%，且第一和第二主成分的解释程度高于90%时，同一组的样品能较好地“聚”在一起。从图5中可以看出，第一和第二主成分的解释程度为93.4%，大于90%，说明样品适合PCA分析。图5中，PC1坐标轴解释了样品细菌主成分差异的82.6%，在此方向上，CTB与其他所有组分群落组成差异较大，说明腌制对样品的菌落组成影响较大；在PC2方向上，CX与CTF的距离最远，说明发酵成熟后，样品的菌落组成发生了较大变化。CTA 、CTC、CTD和CTE的距离较近，说明其群落组成较相近，CTB、CX以及CTF之间的距离较远，说明群落组成差异较大。

2.4 鲟鱼发酵不同时期样品组间物质差异性分析

图6 各组样品的Cladogram图Fig.6 Cladogram analysis of different groups

差异性(LDA effect size，LEfSe)分析可以用于多个分组间的比较，也可实现组内比较，以找出组间在丰富度上具有显著性差异的物种。该分析方法强调统计意义及生物相关性，通过Kruskal- Wallis秩和检验及线性判别分析完成检测[24]。对有详细注释和符合阈值筛选的差异微生物，绘制Cladogram图，结果如图6。从图6中可以看出，各组的优势菌特征不同，其中CTC组的优势特征菌有 Listeriaceae，Carnobacteriaceae， Enterococcaceae，Pseudoalteromonadac和Vibrionales；CTD组的优势特征菌有Lactobacillaceae，Streptococcaceae，Lactobacillales和Bacilli；CTA组的优势特征菌有Rickettsiales，Flavobacteriia，Streptophyta，Chloroplast和ML635J21；CTF组的优势特征菌有Corynebacteiaceae，Actinomycetales和Actinobacteria；CX组的优势特征菌有Myxococcales，Enterobacteriales，Bacillales和Clostridiales；CTB组的优势特征菌有Leuconostocaeae和Erythrobacteraceae；CTE没有找到特征菌，说明这组菌的丰度跟其他组有差异。

在进化分支图中，由内至外辐射的圆圈代表了由门至种的分类级别。在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一种微生物，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。无显著差异的物种统一着色为黄色，每个圆圈颜色代表的分组如图6左上角图例所示。

3 结 论

运用HiSeq高通量测序技术对7个发酵阶段的鲟鱼中细菌群落结构进行分析，结果显示：HiSeq高通量测序技术能充分反映样品中细菌群落结构及优势菌种；随着糟制时间的延长，菌相差别越来越大，样品丰富度越来越少，多样性下降，均匀度变差，并且发现在传统固态发酵鱼中细菌多样性丰富，主要由38个门和196个科组成。

在门水平上，不同发酵时期的鲟鱼细菌的群落分布主要为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。在新鲜鲟鱼肉内Firmicutes和Proteobacteria占的比例大致相同，各占35%左右，但是腌制过后，Firmicutes迅速下降，Cyanobacteria占优势；发酵开始后，Firmicutes占优势，而且比例越来越多；随着发酵时间的延长，变形菌门的比例逐渐下降。样品中Proteobacteria和Firmicutes的数量最多，原因是鱼体本身携带的微生物大多数是革兰氏阴性菌。

在科水平上，鲜鱼中优势菌科为葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和肠杆菌科(Enterobacteiaceae)，随着发酵时间的延长，这两个菌科的比例都逐渐下降。链球菌科(Streptococcaceae)随着发酵时间的延长，在发酵中期成为优势菌科，占30%，到发酵后期虽有略微下降，但依然是优势菌科；明串珠菌科(Leuconostoceae)随着发酵时间的延长，比例逐渐增大，在后期成为优势菌科。

LEfSe分析得出，不同样品组间细菌群落结构存在一定差异。基于新一代高通量测序的宏基因组学分析，不仅可以快速准确地分析鲟鱼发酵过程中微生物群落的结构，并且可确定各种微生物的丰度，对于研究发酵过程中微生物的动态变化具有重要应用价值，希望这些微生物的演替规律可以为发酵鱼的工业化生产提供数据参考。