超高压辅助酶法脱除黄曲霉毒素B1工艺对米糠多肽品质的影响

林奕云， 林耀盛, 郑家概， 林 晨， 付 强， 刘学铭

(1.中国广州分析测试中心 广东省分析测试技术公共实验室， 广东 广州 510070;2.广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室, 广东 广州 510610)

米糠是稻米加工中的主要副产品，是糙米加工成白米过程中碾下的皮层以及少量米胚和碎米的混合物，约占稻谷质量的5%～5.5%[1]。米糠多肽是米糠蛋白经蛋白酶水解获得的不同分子质量的多肽混合物，其氨基酸组成与FAO/WHO的建议模式接近，营养价值可与鸡蛋蛋白媲美；具有易消化吸收，安全无毒，低过敏性等特点[2]。因此，以米糠为原料制备米糠多肽，对于提高米糠的附加值具有重要的现实意义。

米糠虽然有较高的利用价值，但由于其收获、生产、加工、储藏和销售过程中易受黄曲霉和寄生曲霉等感染而产生黄曲霉毒素，导致米糠制品(如米糠多肽)中黄曲霉毒素残留量较高，不能满足国家限量标准的要求(≤10 μg/kg)。且目前大部分米糠仍作为动物饲料，甚至直接以废物丢弃，造成资源的严重浪费。因此，制备米糠多肽的过程中有必要采取措施脱除黄曲霉毒素，生产出安全的米糠多肽。

传统的多肽类物质制备多采用酶解法[3]，通常先采用“碱溶酸沉”工艺从米糠中提取蛋白质，再用蛋白酶对蛋白质进行水解制备多肽。经研究发现，以添加不同黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)初始浓度(20、40、60、80、100 μg/kg)染毒米糠为提取原料，以传统酶法制备米糠肽中AFB1残留量较高，脱除率只达到40.38%～48.69%，终产品米糠肽中AFB1在10 μg/kg以上，仍不能满足国家限量标准[4]。由于米糠蛋白分子的聚合度较强，分子中存在较多的二硫键交联，很难溶解[5]，导致米糠蛋白和多肽的提取得率低，单独酶解法提取蛋白肽得率并不高，难以被利用，而Tang等[6]研究表明超高压等物理法可以使细胞破碎而给酶催化提供合适的环境或者增加蛋白质溶解性，从而提高米糠蛋白及多肽的得率。

本文在酶法制备米糠肽的基础上，经优化，以添加不同AFB1初始浓度提取出安全的米糠蛋白，再用胰蛋白酶在中性性环境下酶解，然后采用一定的超高压和时间处理条件下，制备出安全米糠多肽，所制备的米糠多肽中AFB1残留浓度均符合国标。正如Gomaa等[7]研究证明超高压能引起极性分子振动从而对食品物料中黄曲霉毒素的有效脱除，本实验在超高压辅助酶法制备米糠肽工艺优化中，一方面，经过超高压处理后，促进了米糠聚集物分散，糖基化而具有亲水性，促进碱液与黄曲霉的接触面积，加速黄曲霉的脱除作用，另一方面可能与在该处理过程中形成的糖基化产物有关，即蛋白质上糖链的引入，氢基的亲水特性有助于蛋白质的溶解，但是脱除后其对米糠肽品质的影响仍有待进一步研究。

超高压技术(ultra-high pressure，UHP)是指在高静压(一般为100～700 MPa)下进行处理，常以水或其他流体介质作为传递压力的媒介，以改变物料某些理化特性的目的[8]。超高压技术作为一种食品非热加工技术，具有杀菌、保持食品原有营养成分、护色等特点，与传统提取工艺比较，因高温或高碱提取蛋白肽导致蛋白质变性甚至产生有毒物质而带来的变化、损失及生理活性降低，超高压技术具有不需要有机溶剂消耗，减少了对环境的污染，操作简单等优点，目前在粮油加工中正逐步推广应用[9-10]。本研究以米糠多肽的纯度及回收率、多肽得率、水解度、溶解度、乳化性、起泡性、持水性、持油性等基本性质与功能特性作为检测指标，评估超高压辅助酶法脱除AFB1过程中超高压处理对米糠多肽品质的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

米糠样品：市售，研磨粉碎过80～100目筛，密封4 ℃冷藏。经测定，干基中蛋白质质量分数16.72%。AFB1标准品(纯度>99.0%)，美国Alexis公司；胰蛋白酶，广州市齐云生物技术有限公司。

1.2 实验仪器

Milli-Q Integral 5型超纯水系统，德国Merk Millpore公司；数显电子天平、精密数显pH计，广州市深华生物技术有限公司；SB25-12 DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；RLGY-600型自动超高压仪，温州贝诺机械有限公司；CR22GⅢ型高速冷冻离心机，日本HITACHL公司；SB-1100型水浴锅，上海爱朗仪器有限公司；真空冷冻干燥机，美国Labconco公司；1200HPLC Agilent1260系列高效液相色谱仪配荧光检测器，美国Agilent公司；K8400型蛋白质分析仪，瑞典FOSS ANALYTICALAB公司；UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1超高压辅助酶法制备无毒米糠多肽优化工艺

加标染毒米糠AFB1初始浓度分别为20、40、60、80、100 μg/kg，以1∶9.96的料液比(m(米糠)∶V(H2O)=1 g∶9.96 mL)加入超纯水；用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至8.2，水浴45 ℃下搅拌并超声60 min；用1 mol/L的HCl溶液调节pH值至4.5，酸沉；6 000 r/min离心15 min得沉淀；过滤沉淀水洗复溶，以1∶10料液比(m(溶液)∶V(NaOH溶液)=1g∶10 mL)加入0.08 mol/L NaOH水溶液复溶)，调节pH值至8.0，加胰蛋白酶酶解(加酶量质量分数1.5%)，pH=8.0，时间2.5 h，水浴温度55 ℃，然后采用一定的超高压分别对不同AFB1初始浓度的上述溶液处理0、1、3、5、7、9 min，90 ℃，10 min灭酶，冷却至室温；4 000 r/min离心5 min取上清液；冷冻干燥，得到米糠多肽制品。参考GB/T 5009. 22—2006方法，测定以上米糠多肽制品中AFB1残留量(0.22、0.35、0.63、0.86和1.1 μg/kg)均符合国家标准的要求。

1.3.2超高压处理

样品采用聚乙烯塑料袋(13 cm×17 cm) 2层密封(不留顶隙)，进行超高压处理。实验采用100、200、300 MPa 3个压力等级处理，保压时间(1、3、5、7、9 min)。升压用时约100 MPa/3 s，降压用时约100 MPa/2 s。

1.3.3米糠多肽得率的测定

采用三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)可溶性氮法[11]测定米糠多肽得率，多肽得率见式(1)。

ωtca-nsi=m1/m2×100%。

(1)

式(1)中，ωtca-nsi为三氯乙酸可溶性氮得率,即米糠多肽得率，%；m1为在φ=5%TCA中的可溶性氮质量,mg；m2为原料中的总氮质量，mg。

1.3.4米糠多肽功能特性及营养性质的测定

1.3.4.1 米糠多肽水解度的测定

采用pH-Stat 法测定米糠多肽水解度[12]，见式(2)。

DH=Vb×cb/(α×mP×htot)×100%。

(2)

式(2)中, DH为水解度，%；Vb为碱液体积,mL；cb为碱液浓度,mol/L；α为水解时α-氨基平均解离度；mp为底物中蛋白质质量,g；htot为底物中蛋白质的肽键总数,mmol/(g蛋白)，对于米糠多肽而言，1/α=2.26,htot=8.2。

1.3.4.2 米糠多肽溶解度的测定

采用Lowry法[13]测定米糠多肽溶解度。米糠多肽样品研磨后过80目筛，以pH=7.0的0.05 mol/L磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液配成10 g/L的浓度，25 ℃电磁搅拌1 h，6 000 r/min离心10 min，用Lowry法在分光光度计640 nm处测定上清液的OD值，先获得牛血清白蛋白的标准曲线，再测定上清液中蛋白质含量。米糠多肽样品总蛋白质含量使用微量凯氏定氮法测定。米糠多肽溶解度用氮溶解度指数NSI表示，见式(3)。

NSI=m上清液含氮/m样品含氮×100%。

(3)

1.3.4.3 米糠多肽乳化性的测定

采用浊度法[14]测定米糠多肽乳化性。取1 g/L浓度的多肽溶液63 mL于250 mL烧杯中，加入27 mL大豆色拉油；用高速分散均质机在12 000 r/min转速下分散2 min；用注射器从底部取0.1 mL乳状液，迅速与1 g/L十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)溶液5 mL混合均匀，在500 nm波长下比色，记录吸光度(A0)；10 min后再从底部取0.1 mL乳状液，同样稀释，比色，记录吸光度(At)。多肽的乳化能力以乳化能力指数E0和乳化稳定性指数ESI表示，见式(4)。

ESI=A0×t/(A0-At)。

(4)

1.3.4.4 米糠多肽起泡性的测定

用0.05 moL/L磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH=7.0)配成1 g/L米糠多肽样品，取100 mL用高速分散均质机在10 000 r/min转速下分散2 min；转入250 mL量筒，迅速记录溶液与泡沫总体积V0，将上述体系静置30 min后，测出下层析出液的体积Vt。米糠多肽起泡性和起泡稳定性见式(5)和(6)[15-16]。

起泡性=(V0-100)/100×100%。

(5)

起泡稳定性=Vt/V0×100%。

(6)

1.3.4.5 米糠多肽持水和持油能力的测定

米糠多肽持水性测定参考文献[1]。准确称取米糠多肽样品m0于50 mL离心管中，加入10 mL去离子水，用漩涡混合器混匀，然后4 500 r/min离心15 min，倾去上清液，将离心管斜置30 min，称重mt，见式(7)。

持水能力=(mt-m0)/m0。

(7)

米糠多肽持油性测定参考文献[13]。准确称取米糠多肽样品m0于50 mL离心管中，加入5 mL大豆色拉油，用漩涡混合器混匀，然后4 500 r/min离心15 min，吸去上层未吸附油，称重mt，见式(8)。

持油能力=(mt-m0)/m0。

(8)

1.4 数据处理

实验重复3次，采用OriginPro 8.5绘图和SPSS 11.0进行ANOVA方差分析(Tukey分析均值差异的显著性，显著水平P≤0.05)。

2 结果与分析

2.1 超高压对米糠多肽得率的影响

在不同超高压压力和时间处理下，考察米糠多肽得率的变化见图1和图2。

图1 超高压处理压强对米糠多肽得率的影响Fig.1 Effect of ultra high pressure treatment on purity of rice bran polypeptides

图2 超高压处理时间对米糠多肽得率的影响Fig.2 Effect of ultra high pressure treatment time on yiled of rice bran polypeptides

由图1和图2可知，在0～5 min随着超高压处理时间的延长，米糠多肽的得率逐渐增大，处理时间5 min时米糠多肽的得率最大，但随着超高压处理时间的进一步延长，其多肽得率呈平稳趋势。这可能是Tang等[6]研究表明因为超高压使细胞破碎诱导米糠蛋白质分子产生极化现象，维持蛋白分子空间结构的非共价键被破坏，分子柔性提高，肽键暴露，为胰蛋白酶提供更多酶切位点，因此多肽得率提高。另外，超高压处理也能提高蛋白质酶活性，Kim等[17]以胰蛋白酶为材料，胰蛋白酶具有由组氨酸-57、天冬氨酸-102和丝氨酸-195组成的催化三联体，分别以100、300 MPa的压力处理比较分析，胰蛋白酶活性增强，主要在于酰基-酶中间体的催化三联体在高压下不被破坏，反而因压力的作用使蛋白质内腔压缩导致酶作用部位堆积，更有效地增强酶催化作用。但是，随着超高压处理时间的进一步延长，蛋白质分子进一步展开，极化的蛋白质分子之间相互吸引，通过非共价键重新形成大分子聚集体，分子柔性降低，表面肽键数减少，为胰蛋白酶提供的酶切位点减少，所以多肽得率降低。

2.2 超高压对米糠多肽水解度的影响

实验采用300 MPa超高压，在不同时间处理条件下，考察米糠多肽水解度的变化，见图3。

图3 超高压处理时间对米糠多肽水解度的影响Fig.3 Effect of ultra high pressure treatment time on degree of hydrolysis of rice bran polypeptides

由图3可知，在0～5 min随着超高压处理时间的延长，米糠多肽的水解度逐渐增强，处理时间5 min时米糠多肽的水解度最强，但随着超高压处理时间的进一步延长，其水解度呈下降趋势。这与Zhang等[18]研究超高压结合酶解对鹰嘴豆分离蛋白水解度的影响及其水解物的抗氧化活性时的结果相一致，在300 MPa高压条件下，胰蛋白酶的活性随着时间的增加而增大，其水解度随着增大，维持蛋白质分子空间结构的非共价键被破坏，分子柔性提高，肽键暴露，因此水解度增加。类似研究王章存等[19]采用200～400 MPa的超高压处理使蛋白酶酶解的水解度提高，同时加快了酶解的速度；研究发现适当的压力处理可以改变蛋白质的结构使其紧密的结构伸展或松散、暴露出分子内部的酶作用位点，利于酶解的进行。Tang等[6]研究表明超高压等物理法可以使细胞破碎而给酶催化提供合适的环境或者增加蛋白质溶解性，从而提高米糠蛋白和多肽的得率。但是，随着超高压处理时间的进一步延长，蛋白质分子进一步展开，极化的蛋白质分子之间相互吸引，通过非共价键重新形成大分子聚集体，分子柔性降低，表面肽键数减少，所以水解度降低。

2.3 超高压对米糠多肽溶解度的影响

溶解度是蛋白质及多肽的基本物理性质之一，主要与蛋白质分子表面电荷有关[20]。本实验采用300 MPa超高压，在不同处理时间条件下，考察米糠多肽溶解度的变化，见图4。

图4 超高压处理时间对米糠多肽溶解度的影响Fig.4 Effect of ultra high pressure treatment time on solubility of rice bran polypeptides

在超高压作用下，蛋白质极性分子与水分子变成有序极性分子并且发生高速的振荡、碰撞、摩擦和挤压作用，产生巨大的热量，引起蛋白质等极性分子基团电性质变化，从而使蛋白质功能性质发生变化。如图4可知，相比酶法制备米糠多肽，随着超高压处理时间的增加，米糠多肽的溶解性显著增强，当超高压处理时间超过5 min后米糠多肽的溶解性明显下降。这是因为多肽的溶解性与其表面疏水与亲水作用有很大的关联。由于超高压作用下，多肽分子之间发生了交联，多肽小分子聚集成大分子，而且交联部位很可能集中于疏水基团，以至于米糠多肽亲水性提高，溶解性提高。随着超高压时间的延长，作用力使多肽的球形结构变为棒状结构，疏水基团暴露，疏水残基相互作用形成网络，又会使蛋白质的溶解性降低[21]。

2.4 超高压对米糠多肽乳化性的影响

乳化性是蛋白肽的重要功能之一，是指蛋白肽将油和水结合形成油水乳状液保持稳定的能力，具体包括乳化性和乳化稳定性2个方面。本实验采用300 MPa超高压，在不同处理时间条件下，考察米糠多肽乳化性的变化，见图5。

图5 不同超高压处理时间对米糠多肽乳化性的影响Fig.5 Effect of ultra high pressure treatment time on emulsification capacity of rice bran polypeptides

图6 超高压处理时间对米糠多肽泡沫性的影响Fig.6 Effect of ultra high pressure treatment time on foam capacity of rice bran polypeptides

由图5可知，在0～3 min随着超高压处理时间的延长，米糠多肽的乳化性和乳化稳定性逐渐增强，处理时间3 min时米糠多肽的乳化性和乳化稳定性最强，但随着超高压处理时间的进一步延长，其乳化性和乳化稳定性呈下降趋势。这是因为超高压作用力使米糠多肽分子产生极化现象，维持多肽分子空间结构的非共价键被破坏，分子柔性提高，更多的分子结合到油-水界面；同时，多肽分子内部的疏水残基暴露在蛋白质表面，其表面疏水性增强，故米糠多肽的乳化性和乳化稳定性增强。在300 MPa压力下，水解度随处理时间的延长先增大后减小，在水解度3 min时最大时，乳化性反而降低。这与管军军等[22]研究大豆蛋白的乳化性时也有相似的结果，随着水解度的增大，大豆蛋白的乳化稳定性先上升后下降，这是因为：水解度过大时，随着超高压作用力处理时间的进一步延长，多肽分子进一步展开，会破坏多肽分子中疏水区域的结构，导致疏水区域比例相对减小，所以其乳化性和乳化稳定性呈下降趋势。

2.5 超高压对米糠多肽起泡性的影响

起泡性是指蛋白肽搅打起泡的能力，而起泡稳定性则是泡沫保持稳定的能力。本实验采用300 MPa超高压，在不同处理时间条件下，考察米糠多肽起泡性的变化，见图6。

刘国琴等[23]采用300 MPa的压力处理大豆分离蛋白，发现超高压处理可以增加蛋白质的起泡性。由图6可知，超高压辅助处理可提高米糠多肽起泡性，但是随着超高压处理时间的延长，其起泡稳定性先提高后下降。超高压作用下米糠多肽分子产生极化现象，非共价键被破坏，多肽分子部展开，其内部的疏水残基暴露在多肽表面，促进多肽分子之间相互作用和水—空气界面的形成，形成更稳定的二维网络结构和界面膜，故起泡性和起泡稳定性增强。随着超高压处理时间的进一步延长，多肽分子进一步展开，其内部的疏水基团和巯基进一步暴露，极化的多肽分子之间通过非共价键重新形成分子聚集体，水-空气界面膜的稳定性下降，因此，起泡稳定性呈下降趋势。

2.6 超高压对米糠多肽持水性、持油性的影响

食品加工中蛋白质主要影响食品的口感和风味，蛋白质的持水性能主要影响食品的质地和口感，持油性能影响油脂保留能力，与食品风味密切相关，因此持水性、持油性是食品工过程中非常重要的指标。本实验采用300 MPa超高压，在不同处理时间条件下，考察米糠多肽起泡性的变化，见图7。

由图7可知，超高压处理可明显降低米糠蛋白肽的持水能力，但可提高米糠多肽的持油能力。超高压技术是一种非热加工技术，使得具有操作温度低的优势，有利于保持油脂原有的品质[16,24]。使米糠多肽变性进而聚集成大分子聚合体，从而减少米糠多肽的比表面积和极性基团与水的有效结合，使得米糠多肽的水合能力因多肽间相互作用的增强而降低，反之，却提高了米糠多肽的持油能力。

图7 超高压处理时间对米糠短肽持油性和持油性的影响Fig.7 Effect of ultra high pressure treatment time on water retention and oil holding capacity of rice bran polypeptides

3 结 论

研究表明在超高压300 MPa条件下，随着超高压处理时间(0、1、3、5、7、9 min)的延长，超高压辅助酶法制备无毒米糠多肽的多肽得率、水解度、溶解性、起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性先提高后下降；起泡性和持油性显著提高；而持水性呈下降趋势。由此可得出结论：在确保米糠多肽安全无毒的前提下，超高压辅助酶法降解AFB1优化工艺对米糠多肽品质有一定的影响，并且总体上呈现较好的趋势，但该超高压工艺对米糠多肽分子结构和活性的影响机制尚不完全明确，超高压对蛋白肽活性区域和多聚体蛋白结合区域分子结构的影响仍需进一步研究。