微生物对储藏稻谷结块及品质影响的研究

何 荣 章 铖 陈尚兵 汪 静 邹昱成 邢常瑞 袁 建 鞠兴荣

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心；江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

我国经济进入新常态时期，实施科技兴粮工程、促进粮食科技创新发展是贯彻国家粮食安全新战略的根本要求[1]。“十三五”规划提出：“坚持最严格的耕地保护制度，坚守耕地红线，实施藏粮于地、藏粮于技战略，提高粮食产能，确保谷物基本自给、口粮绝对安全[2]。”国家对粮食安全问题是高度重视，因此粮食科技工作需要紧紧围绕国家粮食安全战略，聚焦粮食安全，重点攻克绿色生态储粮、粮食节约减损、质量卫生安全等重大科技难题[3]。

粮食作为生命体，收获后到储藏环节与环境形成了储粮生态系统，储粮生态系统包括温度、湿度、微气流等非生物因素和微生物、虫害等生物因素，这些均是影响储粮生态系统稳定的重要因素[4]。而粮食结块是粮食储藏过程中存在的一个重大安全问题，粮食结块不仅会降低粮食品质，还会对粮食出仓造成困难，经常造成漏斗堵塞，在清理粮食结块的过程偶有人员伤害等事故发生[5]。结露会使粮堆局部水分含量升高，易引起粮食呼吸旺盛，微生物活动加剧，若处置不当则最终会引起粮堆结块[6]。实际生产中加强对粮食储藏环境的管理，如合理通风以及在钢板筒仓外层采取保温等措施，可以有效避免粮食结块的发生[7]。微生物活动是导致粮食结块的主要成因，微生物为了生存就必须从环境中分解和吸收营养物质，用以合成自身的细胞物质并获得代谢所需要的能量，而粮食就是微生物天然的营养库[8]；并且粮食中微生物的活动时刻影响着粮食的品质，甚至降低粮食的营养成分，影响粮食的食用价值和加工质量[9]。

微生物活动易导致稻谷结块，而对于粮食结块起最大“贡献”的微生物却鲜有研究；此外，以及稻谷结块品质变化与成因之间的关系尚不明确，其中蕴含许多科学问题亟待解决。相比细菌而言，霉菌更易引起粮堆结块[10]，本实验选用黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、产黄青霉、灰绿曲霉这5种常见的霉菌对稻谷进行污染的接种处理，最终引起稻谷结块，通过测定结块稻谷的质量指标，分析稻谷品质变化与稻谷结块成因之间的关系，以期为我国粮食安全储藏提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2017年南京秋收新粮(粳稻)；直链淀粉标准溶液、乙醇、盐酸、氢氧化钠(所涉及的化学试剂均为优级纯)；α-淀粉酶活性检测试剂盒、过氧化物酶测试盒、脂肪酶(LPS)活性检测试剂盒；黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、灰绿曲霉、产黄青霉：均来源于实验室对储粮霉菌的分离纯化。

PQX-300D多段可编程人工气候箱、Perten RVA4500型快速黏度分析仪、BLH-3250型实验砻谷机、JNMJ6型检验碾米机、D/max 2500 PC型X射线衍射仪、TM3000型扫描电子显微镜、Spectramax M2e型多功能酶标仪。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物培养与接种

将黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、产黄青霉、灰绿曲霉五种有害霉菌分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，置于28 ℃、85% RH恒温培养箱中，待霉菌生长14 d后产生大量的孢子，用无菌水(121 ℃、20 min)冲洗培养基表面，制作成霉菌的孢子悬浮液，采用平板计数法分别测定5种霉菌孢子悬浮液的孢子浓度，并将其浓度调整至105～106CFU/mL。之后将5种霉菌孢子悬浮液，置于4 ℃冰箱储存备用。

将稻谷样品(热风灭菌处理)分为若干份，每份质量50 g，分装于直径为150 mm的培养皿。并随机抽取装有稻谷样品的培养皿若干，作为空白对照组，其余为实验组。实验组的每份稻谷样品表面接种1 mL菌液，由于所接种的霉菌类别不同，将接种黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、产黄青霉、灰绿曲霉的实验组依次命名为实验组1～5，此外实验组设平行对照若干。对照组的每份稻谷样品加入1 mL无菌水，充分混匀后将培养皿放置于的人工气候箱中储藏(28 ℃、60% RH)。样品从接种霉菌起，每7 d，随机选取实验组1～5与对照组中的稻谷样品各1份进行菌落总数的测定。

1.2.2 霉菌孢子悬浮液孢子数测定

参照LS/T 6132—2018《粮油检验 储粮真菌的检测》孢子计数法进行测定[11]。

1.2.3 霉菌菌落总数测定

参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验》霉菌和酵母计数进行测定[12]。

1.3 稻谷质量指标检测

出糙率测定：参照GB/T5495—2008《粮油检验 稻谷出糙率检验》执行[13]；不完善粒测定：参照GB/T 5494—2008《粮油检验 粮食、油料的杂质、不完善粒检验》执行[14]；整精米率测定：参照GB/T 21719—2008《稻谷整精米率检验法》执行[15]；垩白粒率测定：参照GB/T 17891— 2017《优质稻谷》执行[16]。

1.4 稻米粉品质测定

1.4.1 测试样品前处理

稻谷样品经砻谷机脱去颖壳，得到糙米。再将糙米经碾米机碾磨90 s，除去糠粉后，得到加工精度达到国家标准的三级精米[17]。精米经粉碎机粉碎，并过100目筛，用于后续相关指标的测定。

1.4.2 水分含量的测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》(直接干燥法)[18]。

1.4.3 游离脂肪酸值测定

参照GB/T 5510—2011《粮油检验 粮食、油料脂肪酸值测定》(石油醚提取法)[19]。

1.4.4 直链淀粉含量的测定

参照GB/T 15683—2008《大米 直链淀粉含量的测定》[20]。

1.4.5 α-淀粉酶活力测定

采用北京索莱宝科技有限公司生产的α-淀粉酶活性检测试剂盒。

测试原理：淀粉水解酶催化淀粉水解生产还原糖，还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，通过测定540 nm吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。淀粉酶活力以每g稻谷每分钟催化产生1 mg还原糖定义为1个酶活力单位。

1.4.6 过氧化物酶活力测定

采用南京建成生物工程研究所生产的过氧化物酶测试盒。

测试原理：利用过氧化物酶催化过氧化氢反应的原理，通过测定420 nm处吸光度的变化得出其酶活性。以每克稻谷每分钟催化1 μg底物的酶量定义为一个酶活力单位。

1.4.7 脂肪酶活力测定

采用北京索莱宝科技有限公司生产的脂肪酶(LPS)活性检测试剂盒。

测试原理：LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用铜皂法测定脂肪酸生成速率，通过测定420 nm处吸光度的变化，即可计算LPS活性。以每克稻谷每分钟水解橄榄油生成 1 μmol 脂肪酸为一个酶活单位。

1.4.8 糊化特性的测定

参照GB/T 24852—2010大米及米粉糊化特性测定 快速粘度仪法(RVA)[21]，测定各稻谷样品的糊化特性的特征值。

1.4.9 X射线衍射测定

采用X射线衍射仪对实验组与对照组样品的晶体结构进行检测，测定条件如下：铜靶，石墨单色器，电压为40 kV，电流为100 mA，发射狭缝为1°，防散射狭缝为1°，接受狭缝为0.15 mm，2θ扫描区间为5～40°，扫描速度为5(°)/min，2θ/θ连续扫描，步长0.02°，并用MDI JADE6.5软件计算结晶度[22]。

1.4.10 扫描电子显微镜测试

将稻谷样品导电胶固定在载物台，喷金处理后，放入样品腔进行观察，加速电压为15 kV，观察并拍摄样品的颗粒形貌。

1.5 图表绘制及数据处理

图表由Origin Pro 2016绘制，数据由IBM SPSS 22.0进行分析和处理。

2 结果分析

2.1 霉菌对稻谷结块的影响

稻谷储存35 d，实验组与对照组稻谷的表观形貌如图1所示。由图1可观察到1号、3号、4号实验组的稻谷存在较明显的霉变现象，并且整体伴随着较明显的结块现象。2号实验组部分区域存在霉变，而霉变区域处的少量稻谷存在结块现象，5号实验组稻谷的霉变与结块现象轻微。微生物的繁殖与增长是导致稻谷结块的一个重要原因[22]，本实验选用5种较常见的霉菌，对稻谷进行污染的接种处理。在接种霉菌前先对稻谷进行灭菌处理，因此可认定稻谷所接种的霉菌是稻谷期生长初期的优势菌。

图1 稻谷表观形貌

实验组与对照组稻谷的霉菌生长情况如图2所示，由图2可知1号、3号、4号实验组所接种的霉菌生长较快。该现象与图1观察到的稻谷的表观形貌规律一致，霉菌生长较快的实验组的稻谷发生了较严重的结块和霉变现象，其余实验组次之。1、3、4号实验组所接种的霉菌分别对应为黑曲霉、黄曲霉、产黄青霉，由此可判断黑曲霉、黄曲霉、产黄青霉较易导致稻谷结块。虽然在稻谷储藏的过程中霉菌会发生一定的演替规律，优势菌也会随之发生变化，但该实验结果对稻谷结块的成因仍具有一定的参考价值。周建新等[23]在研究不同储藏条件下稻谷霉菌区系演替规律时发现，粳稻谷所含霉菌的优势菌最终会向黄曲霉、黑曲霉、白曲霉演替，这也一定程度上验证了黄曲霉、黑曲霉、产黄青霉较易导致稻谷结块的规律。此外稻谷的结块还与稻谷的水分含量、环境温湿度相关，当稻谷的储藏温度、湿度及水分含量越高时，稻谷中霉菌繁殖增快并且霉菌菌丝互相连结，形成菌落，稻谷中有机质被逐渐消耗，最终造成稻谷结块、霉变[24]。

图2 霉菌生长曲线

2.2 结块稻谷储藏品质分析

稻谷质量指标检测结果如表1所示，对照组的稻谷品质与初始值相比，在出糙率、整精米粒率上略有下降，而不完善粒率有所升高。该结果意味着稻谷在储藏过程中品质发生了轻微的劣变。再对比于实验组与对照组的物检测试结果，实验组稻谷的出糙率、整精米粒率要显著低于对照组，并且不完善粒率明显增加。根据国家优质稻的评判标准分析，三级粳稻谷的整精米率需≥55%，不完善粒率≤5%，实验组的稻谷均无法达到国家三级粳稻谷的要求。并且在物检过程中发现实验组的稻谷脱壳后发现霉变粒、病斑粒、虫蚀粒的含量显著增加，因此导致稻谷不完善粒率的增加。另外稻谷出糙率的计算方法为完善粒的质量加上一半不完善粒质再除去测试稻谷的总质量，因而导致实验组稻谷出糙率的值低于对照组。整精米率是评价稻谷加工品质优劣的重要指标,与碾米厂的经济效益密切相关。对照组与初始值相比稻谷的整精米率略有降低，是由于稻谷在储藏过程中呼吸作用使干物质不断被消耗，从而导致稻谷组织疏松，整精米率下降[25]。实验组与对照组相比，稻谷的整精米率显著下降，在物检过程中发现部分实验组稻谷通过碾米机后碎米粒较多，因而导致整精米率下降。此外，从表1数据分析发现各个实验组稻谷的出糙率、不完善粒、整精米率与稻谷的结块程度呈现一定的相关性，1号、2号、4号实验组稻谷结块、霉变程度较大，其出糙率、整精米率与其他实验组相比略低，而不完善粒率较高。垩白是指稻米淀粉体排列不紧密呈现出的散光不透明部分，是稻米外观品质的重要影响因素。稻谷中垩白粒的形成主要与水稻的生长环境及品种遗传相关[26]，从表1的物检结果中发现，实验组与对照组及初始值之间并不存在非常显著的差异，表明稻谷储藏对垩白粒率的影响并不大。

表1 稻谷质量指标检测结果

注：初始值为储藏第0天稻谷样品的测试结果。数值以平均值±标准差的形式表示，同一列中小写字母不同表示组别之间存在显著性差异(P<0.05)，余同。

稻谷储藏期间酶活性的变化与稻谷品质变化以及稻谷结块、霉变存在一定的相关性。通过对实验组与对照组稻谷的酶活力进行测试，有助于从酶活动的角度解释和分析稻谷结块、霉变，实验组与对照组的稻谷品质指标测试结果如表2所示。稻谷中的淀粉酶有3种，分别为α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶。其中α-淀粉酶对谷物食用品质影响较大。随着大米储藏时间的延长，α-淀粉酶活性降低，并且有研究发现α-淀粉酶活性与大米陈化时流变学特性的变化相关[27]。由表2数据可知，对照组与初始值相比淀粉酶的活力降低了0.12 mg/(min·g)，并存在显著差异，表明淀粉酶的活力会随储藏时间的延长而降低[28]。而比较实验组与对照组淀粉酶活力的数据，实验组的淀粉酶活力远远低于对照组，说明储藏期间实验组稻谷的淀粉酶已充分发挥其活性，水解淀粉分子链中的α-1,4-糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精、寡糖和少量麦芽糖和葡萄糖。稻谷中主要的营养成分为淀粉，而α-淀粉酶的活动能够对淀粉的结构产生一定的影响，推测稻谷结块可能与淀粉的结构变化有关。此外，发现随着储藏时间的延长，实验组与对照组的直链淀粉含量升高，原因是一部分支链淀粉在脱支酶的作用下变为直链淀粉，直链淀粉含量的增加，易导致米饭蒸煮过程中水分难以渗透，制得的米饭口感较硬[29]。

过氧化物酶存在于所有的粮食籽粒中，粮食储藏过程中口感下降，甚至变苦与过氧化物酶的活性有密切关系。吴金兰等[30]研究发现大米随着储藏时间的延长，过氧化物酶活性不断减弱，并与大米脂肪酸值上升存在极好的负相关性。而脂肪酶能把脂肪中具有孤立不饱和双键的不饱和脂肪酸氧化为具有共轭双键的过氧化物，是造成酸败的必然条件[31]。观察表2数据发现，随着储藏时间的延长，实验组与对照组的过氧化物酶与脂肪酶的活力较初始值相比均下降了，而实验组的过氧化物酶与脂肪酶的活力要低于对照组并存在显著差异(P<0.05)。各个实验组之间，结块较严重的1号、3号、4号实验组的过氧化物酶与脂肪酶的活力与其余实验组相比相对较低。脂肪酸值是粮食储藏过程中品质变化的重要指标之一，一般来说脂肪酸值越高,粮食品质越差。根据国家标准中对稻谷储存品质的判定，粳稻谷脂肪酸值≤25.0为宜存，≤35为轻度不宜存[16]。表2中对照组的脂肪酸值为18.6 mg KOH/100 g与初始值相比升高了8.2 mg KOH/100 g，但仍符合优质稻谷适宜储存的评价标准。1号～5号实验组稻谷的脂肪酸值与对照组相比明显升高了，存在显著性差异(P<0.05)，并且大部分稻谷已不适宜继续储存。根据上述结果可以得出在稻谷结块过程中，过氧化物酶和脂肪酶主要是导致稻谷的脂肪酸值升高，而宏观上则体现为稻谷气味酸败和口感变苦。

表2 稻谷品质指标测试结果

2.3 结块稻谷糊化特性分析

糊化过程中的特征值主要有峰值黏度、崩解值、衰减值、回生值、最低黏度、最终黏度等。这些糊化过程中的特征值可以一定程度上反映淀粉的黏滞特性与米饭的食味品质[23]。稻谷淀粉糊化过程中的特征值如表3所示。崩解值为峰值黏度与热浆黏度的差值，是衡量米粉热糊稳定性的指标。此外，缪铭等[33]的研究表明，淀粉总体的崩解值与淀粉的消化性能呈极显著正相关。稻谷中的淀粉与脂类紧密结合，而随着储藏的进行，淀粉粒表面的亲水作用减弱，使得体系的抗剪切能力下降，淀粉粒易破裂，因此崩解值下降[34]。因此储藏35 d的对照组的稻谷的崩解值与初始值相比下降，并存在显著性差异(P<0.05)。此外，接种霉菌的实验组崩解值处于1 377.5～1 587.2 cP的范围，而未接种霉菌的对照组在崩解值约为2 075.0 cP，二者存在着显著性的差异(P<0.05)，由此可知结块和霉变的稻谷中的淀粉结构发生了一定的变化，使得淀粉抗剪切能力下降，淀粉粒更易破裂。另外实验组的峰值黏度与对照组相比偏低，反映出α淀粉酶活性下降，该结果与表2中淀粉酶活性测试结果一致。

消减值为最终黏度与峰值黏度的差值，它反映了米粉冷糊的稳定性和老化性。米饭硬度、黏性与消减值之间存在极显著的相关性。消减值越大，米饭就越硬，黏性就越小[35]，相对而言品质较差。从表3数据来看，实验组的消减值处于41.5～296.2 cP的范围，对照组的消减值约为-433.1 cP。对照组的消减值为负值，远远小于实验组，二者存在着显著性的差异(P<0.05)。由此可推断由结块和霉变的稻谷所制得的米饭，其硬度大，黏性小，整体品质较差。

回生值反映淀粉冷糊的稳定性和老化趋势。回生值的高低与它们的直链淀粉的聚合度和支链淀粉的结构有关，直链淀粉聚合度高，支链淀粉外链长的淀粉易于老化[36]。从表3数据分析，对照组与结块霉变的实验组之间并没有存在显著性的差异。糊化温度也是用于衡量淀粉品质的一个重要指标，当温度高于糊化温度时晶体崩解，淀粉颗粒开始溶胀，黏度突然升高，并逐渐达到峰值黏度。而糊化温度的大小主要受直链淀粉含量、结晶度和支链淀粉结构等因素影响。实验组的糊化温度处于73.2～75.1 ℃的范围，对照组的糊化温度约为71.1 ℃，实验组稻谷样品的糊化温度要略高于对照组，并存在显著性差异(P<0.05)。一般来说，直链淀粉含量与结晶度较高的淀粉晶体结构紧密，晶体熔解所需热量大，导致糊化温度较高[37]。

综上所述，可以合理推测稻谷在结块的过程中，淀粉的抗剪切能力下降，淀粉粒也更易破裂；直链淀粉含量与淀粉结晶度升高，所制得的米饭硬度较大，粘性较小，整体品质较差。

2.4 X射线衍射分析

淀粉结晶度是表征淀粉颗粒结晶性质的一个重要参数，其大小直接影响着淀粉产品的应用性能。而淀粉经过物理、化学或生物处理之后，其结晶度的变化在可以一定程度上反映淀粉颗粒内部结构的变化[38]。由于晶体能对X射线产生衍射效应，因此常利用这种衍射测定淀粉颗粒中晶体结构的信息[39]。X射线衍射测试结果如图3所示，图3中实验组与对照组的X射线衍射测试结果较相似，均在2θ为15°、17°、18°及23°附近表现出强的衍射峰，说明稻谷结块、霉变前后的淀粉晶体结构没有发生变化，仍然为A型晶体结构[40]。此外，通过X射线衍射谱图处理软件MDI JADE 6.5对测试结果进行淀粉结晶度计算，计算结果在图3中进行标注。计算发现实验组与对照组的淀粉在结晶度上存在较明显的差异，实验组的淀粉结晶度要高于对照组，并且图1中稻谷结块、霉变明显的实验组的淀粉结晶度也相对较高。该结果表明在稻谷结块、霉变后淀粉的结晶度增加，并与结块稻谷的糊化特性分析中所发现的规律一致，由于淀粉结晶度的增加而导致了淀粉糊化温度升高。

表3 稻谷淀粉糊化过程中的特征值

图3 X射线衍射测试结果

2.5 扫描电子显微镜分析

本研究采用扫描电子显微镜观察稻谷结块前后稻米粉(<100目)的颗粒形态变化。扫描电子显微镜测试结果如图4所示，拍摄放大倍数为4 000。由扫描电镜图可以看出对照组的稻米粉分散松散，无明显聚集，并且稻米颗粒表面较光滑、平整(图4a)。由图4b～图4f观察发现，结块、霉变实验组的稻谷颗粒表面凹凸不平，颗粒感强。图4e观察到稻谷颗粒表面存在许多孔隙，推测这部分孔隙可能是稻谷所含的微生物分解并吸收稻谷的营养物质所造成的。此外，在扫描电镜中观察到图4c与图4f微小颗粒的聚集程度要小于图4b、图4d、图4f，宏观则表现为2号实验组与5号实验组的结块、霉变程度小于其他实验组。稻米粉的主要成分为淀粉，扫描电镜图中所观察到的微小颗粒也大多为淀粉颗粒，淀粉颗粒的聚集使得淀粉的结晶度增加，这与淀粉糊化特性和X射线衍射的分析结果一致。由此推测微观层面上稻谷内淀粉结构的变化是引起稻谷宏观品质变化的重要因素。

注：a～f依次为对照组、1号～5号实验组。图4 扫描电子显微镜测试结果

3 结论

分析不同微生物对稻谷结块的影响。将稻谷分别接种黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、产黄青霉、灰绿曲霉这5种常见的霉菌，并进行储藏实验。研究发现，优势菌为黑曲霉、黄曲霉以及产黄青霉的实验组霉菌生长较快，易引起稻谷的结块。

结块稻谷储藏品质分析：结块的稻谷的出糙率、整精米粒率较低，并且不完善粒率明显增加，其中结块稻谷的整精米率<55%，不完善粒率>5%，已无法达到国家三级粳稻谷的要求。

结块稻谷糊化特性分析：结块稻谷的崩解值处于1 377.5～1 587.2 cP的范围，显著低于对照组(2 075.0 cP)；结块稻谷的消减值处于41.5～296.2 cP的范围，显著高于对照组(-433.1 cP)；结块稻谷的糊化温度处于73.2～75.1 ℃的范围，显著高于对照组(71.1 ℃)。由此推测结块的稻谷中的淀粉结构发生了一定的变化，使得淀粉抗剪切能力下降，淀粉粒更易破裂，而所制得的米饭，其硬度大，黏性小，整体品质较差。

结块稻谷微观结构分析：结块稻谷其淀粉结晶度较大并且微观结构存在淀粉颗粒团聚现象，从而导致了淀粉糊化温度升高。由此可知微观层面上稻谷内淀粉结构的变化是引起稻谷宏观品质变化的重要因素。