基于超滤技术的苦荞提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

李云龙 韩 林 王 敏

(山西省农业科学院农产品加工研究所1，太原 030031) (西北农林科技大学食品科学与工程学院2，杨凌 712100)

荞麦(Fagopyrum tataricum)，又名三角麦、乌麦等，是一种蓼科荞麦属植物，主要栽种于北半球高寒地区[1]。世界上有15个荞麦品种，目前，主要的种植品种为甜荞和苦荞，其中苦荞由于含有更丰富的酚类等活性成分，近年来备受关注[2]。苦荞(Fagopyrum tatarium Gaertn.)，也称鞑靼荞麦，在我国主要种植于山西、陕西、贵州、云南、四川和内蒙古等省区[3]。苦荞中含有丰富的蛋白质(13.15%)、淀粉(57.40%)和油脂(3.84%)等营养物质，同时也含有大量的酚类物质，苦兴2号、迪庆苦荞、西农9940等不同品种及其不同部位(麸、壳、粉)中总酚的含量分别为5.15～9.66和0.98～9.31 g/100 g DW，其中以芦丁和槲皮素等为主[4，5]。除了酚类物质外，苦荞中的其它活性成分如D-手性肌醇、D-荞麦碱等近年来也逐步被深入研究[6，7]。

大量流行病学研究和动物实验均表明，苦荞具有多种生理功效，如降血糖、抗氧化、抗癌、抗炎、降血脂、降血压等[8-9]。Skrabanja等[10-11]在人体实验中发现食用含荞麦50%的面包可降低餐后血糖和胰岛素水平，而2型糖尿病患者食用荞麦后2 h，其血糖水平与对照相比可下降51%(P<0.05)。伍杨等[12]利用四氧嘧啶造高血糖大鼠模型，饲喂含苦荞的标准饲料6周后发现，大鼠空腹血糖水平显著降低，血清TC和TG水平也较高脂饲料组明显下降。α-葡萄糖苷酶是一种位于小肠刷状细胞表面的碳水化合物消化酶。因此，抑制α-葡萄糖苷酶活性，可以降低餐后血糖水平。体外实验表明，苦荞提取物对α-葡萄糖苷酶活性具有显著的抑制作用，深入研究发现提取物中的主要成分芦丁、异槲皮素和槲皮素均具有良好的酶活抑制作用，其中槲皮素的效果比降血糖药物阿卡波糖还要强[13，14]。然而，苦荞提取物成分较为复杂，其中是否还有更多更有效的α-葡萄糖苷酶活性抑制成分尚未完全研究清楚。因此，本课题利用超滤技术，分离苦荞中α-葡萄糖苷酶活性抑制成分，再利用HPLC进行分析，同时采用分子模拟对接技术初步研究了这些成分对α-葡萄糖苷酶抑制的作用机理，以期为深入开发和利用苦荞资源提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞(Tartary buckwheat)，品种为西农9940，来源于西北农林科技大学榆林小杂粮试验示范站。

标准品芦丁、槲皮素、肉桂酸、鞣花酸、对香豆酸(纯度>98%):上海源叶生物技术有限公司；α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖:Sigma公司；无水乙醇、丙酮等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

merck millipore超滤管(10 kD)；LC-20高效液相色谱仪；RE52-86A旋转蒸发仪；LGJ-25C真空冷冻干燥机；UV3100紫外-可见分光光度计；HC-2516高速离心机。

1.3 方法

1.3.1 不同溶剂苦荞提取物的制备

将苦荞种子粉碎后，过40目筛。准确称取50 g苦荞粉，分别加入200 mL水、80%乙醇(V/V)和30%丙酮(V/V)，40 ℃超声(80 kHz)提取20 min，然后5 000 r/min离心10 min，收集上清液，残渣再分别用溶剂提取2次，离心后收集上清液，旋转蒸发浓缩后置于真空冷冻干燥机中干燥，-20 ℃保存，备用[15]。

1.3.2 不同溶剂苦荞提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

取10 μL不同浓度(2～32 mg/mL)的苦荞提取物，分别加入10 μL PBS(pH 8.6)和10 μL 0.5U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，混匀后于37℃孵育15 min，再加入20 μL 3 mmol/L的pNPG，再孵育10 min，加入150 μL 0.1 mol/L的Na2CO3终止反应。利用酶标仪在405 nm处测定吸光度，分别设置空白组和对照组，同时以阿卡波糖作阳性对照[16]。提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用按公式计算：

抑制率=[1-(As-Ab)/Ac]×100%

式中：As为样品组吸光值；Ab为空白组吸光值；Ac为对照组吸光值。

1.3.3 超滤实验

将3种提取物溶解于10 mmol/L的乙酸铵缓冲液(pH=6.86)中，过0.45 μm滤膜，配制成2 mg/mL浓度的溶液，按图1所示流程图进行超滤实验，具体操作为：分别取200 μL的样品，加入200 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，置于摇床中37 ℃、500 r/min孵育30 min。将混合物转移至超滤管中，10 000 r/min离心15min，加入100 μL乙酸铵缓冲液重复操作3次，除掉未结合的物质。然后再加入100 μL pH 3.3的甲醇-水溶液(50∶50，V/V)，轻轻振摇超滤管，释放与酶结合的物质，10 000 r/min离心15min，再加入甲醇-水溶液重复操作3次，收集滤液，利用真空冷冻干燥机干燥后，加入200 μL甲醇-水溶液(50∶50，V/V，色谱纯)复溶，备用[17-18]。

1.3.4 HPLC分析

HPLC分析条件：色谱柱为Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长254 nm；流动相A为pH 2.6的磷酸水，流动相B为色谱甲醇；洗脱条件：0～15 min 15%-25%的流动相B，15～25 min 25%-75%的流动相B，25～65 min 75%-15%的流动相B，流速为0.8 mL/min。根据样品中活性成分与标品的保留时间进行定性[19]。

1.3.5 芦丁和槲皮素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

将芦丁和槲皮素标准品配制成不同质量浓度(12.5～150 μg/mL)的溶液，按1.3.2方法验证其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

1.3.6 分子模拟对接

采用Sybyl-X 2.0软件获得芦丁和槲皮素的分子结构，并进行加氢和结构优化处理。从Protein Data Bank(PDB)获取α-葡萄糖苷酶的3D结构(PDB ID：3A4A；gi number:411229),并进行去水分子、去电荷和加氢等处理，利用Sybyl-X 2.0软件中的Surflex-Dock程序进行分子模拟对接，运行次数为100次[16]。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂苦荞提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

由图1可知，苦荞水提取物、80%乙醇提取物和30%丙酮提取物均对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，并随着质量浓度的增大，抑制效果增强，其中80%乙醇提取物抑制效果最为明显，其次为30%丙酮提取物，而水提取物相对较差，说明苦荞中水溶性的成分(如多糖等)对α-葡萄糖苷酶活性影响较小，而极性相对较小的成分(如黄酮等)则影响较大，这与滕俊英等[20]和李艳琴等[21]的研究报道一致。

图1 苦荞不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

同时，在一定浓度范围内(8～32 mg/mL)80%乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用高于阳性对照药物阿卡波糖，显示了其良好的活性，因此后续实验采用80%乙醇提取物进行。

2.2 HPLC分析

利用超滤管，将80%乙醇提取物中与α-葡萄糖苷酶结合的物质，即发挥抑制作用的成分进行分离，收集后真空冷冻干燥，再加入200 μL甲醇-水溶液(50∶50，V/V，色谱纯)复溶后进行HPLC分析，结果见图2。分离得到的与α-葡萄糖苷酶结合的活性成分主要有3个，出峰时间集中在52～62 min。在相同液相条件下，通过与标准品的出峰时间进行比对，可以初步确定其中的两种物质分别为芦丁和槲皮素。芦丁是槲皮素的芸香糖苷，两者都属于苦荞中的黄酮类物质。王斯慧等[22]研究表明，苦荞黄酮对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用，均优于阿卡波糖，而朱丽艳等[23]的研究结果也表明，荞麦中的黄酮和槲皮素可以显著抑制大鼠小肠α-葡萄糖苷酶活性，并对大鼠餐后血糖也有明显的抑制效果。苦荞中黄酮的主要成分为芦丁和槲皮素，因此上述研究结果与本实验结果基本一致。此外，另一种出峰时间为56.55 min的活性成分则有待进一步研究。

图2 HPLC图

2.3 芦丁和槲皮素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

为了进一步验证芦丁和槲皮素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，配制不同浓度的芦丁和槲皮素溶液，按1.3.2方法验证两者的活性，结果如图3所示。随着质量浓度的增加，槲皮素和芦丁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制也逐渐增强，二者呈一定的线性关系，其IC50值分别为32.22 μg/mL和121.05 μg/mL。Li等[14]研究表明，芦丁和槲皮素均能与α-葡萄糖苷酶结合，导致静态的荧光淬灭效应，形成一个新的复合物，其中槲皮素的结合常数大于芦丁，说明槲皮素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比芦丁强，这与本实验结果一致。然而，由于苦荞在萌动或加工过程中，芦丁会被芦丁降解酶水解，生成槲皮素，从而被吸收利用[24]，因此，两者在体内均可能对α-葡萄糖苷酶活性发挥显著的抑制作用。

图3 不同浓度槲皮素和芦丁对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.4 分子模拟对接

为了进一步阐明芦丁和槲皮素与α-葡萄糖苷酶之间相互作用的分子机制，采用Sybyl-X 2.0软件分别对其进行分子模拟对接。由图4可知，芦丁和槲皮素均可嵌入α-葡萄糖苷酶的活性中心，与其发生相互作用，从而减少与底物之间的结合。其中，芦丁分别可以与活性中心的GLU410、GLU2、GLU374和ARG28等氨基酸残基形成氢键，其平均键长为2.19Å，而槲皮素则主要与GLU374、ARG28和ASN9等氨基酸残基相互作用，其中分别与GLU374和ARG28形成2个氢键。说明芦丁和槲皮素与α-葡萄糖苷酶之间的主要相互作用力为氢键。研究表明，多酚类化合物中羟基数量与其α-葡萄糖苷酶抑制活性具有很强的相关性，特别是A环和C环上羟基的数目与位置尤为重要[25]。同时，多酚类物质的分子量大小也会影响其α-葡萄糖苷酶抑制活性。相比于槲皮素，芦丁含有更多的羟基，通过分子模拟对接可知，其与α-葡萄糖苷酶的多个氨基酸残基形成氢键，从而抑制酶活性，然而由于其分子量较大，因此对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率反而更小[16]。此外，分子模拟对接结果也表明，与槲皮素相互作用，形成氢键的GLU374、ARG28和ASN9等氨基酸残基对于α-葡萄糖苷酶的活性影响更显著。

图4 分子模拟对接图

3 结论

本研究比较了苦荞不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，结果表明80%乙醇提取物的抑制效果最为明显，其次为30%丙酮提取物，而水提取物相对较差，说明苦荞中发挥α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分主要溶解于80%乙醇溶剂中。以α-葡萄糖苷酶为“分子印迹”的模板，结合超滤技术和HPLC分析，从苦荞80%乙醇提取物中初步筛选出3种活性成分，并鉴定出其中2种为苦荞中的主要黄酮成分芦丁和槲皮素。结果表明，芦丁和槲皮素均可显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其中槲皮素的作用效果更强。此外，分子模拟对接试验进一步揭示了两种活性成分与α-葡萄糖苷酶之间的相互作用机制。