神经营养因子-3促进神经干细胞定向分化的实验研究

李 凯 李会会 徐婉茹 朱 彤 吴晓燕 韩 凌 陈 刚

1)菏泽市立医院,山东 菏泽274000 2)苏州大学第二附属医院,江苏 苏州215000

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxie-ischemiceneephalopathy,HIE)在临床工作中十分常见,发病率呈逐年升高趋势,其发生、发展与围产期窒息有密切关系,是新生儿神经系统疾病的主要病因[1-2]。病理改变主要是脑水肿、脑细胞坏死,以及神经胶质细胞增生,常伴有继发性癫痫、智力迟钝等各种严重的神经系统后遗症,重度HIE 是导致新生儿死亡的一个重要原因。特别需要关注的是HIE抢救成功后,是否存在后遗症可能在短期内不会有所表现,而是在其成长的过程中逐渐表现出来(如运动和智力发育不能达到同龄儿应该达到的标准),导致患儿后期生活质量低下,严重损害患儿的生命健康,也给患儿家庭带来极大的经济负担及社会压力[3-6]。临床除了一些后期的营养神经、康复治疗无其他更好的治疗方法。

目前,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是研究的热点。神经干细胞是可多向分化呈各种类型的细胞的一类原始细胞[7-9],在一定环境下具有多向定向分化功能,如分化为神经元细胞、少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)、星形胶质细胞(astrocyte,AS)等,在一定程度上可以帮助修复损伤的神经细胞,从而为NSCs移植治疗相关疾病提供了科学依据[10]。研究发现,NSCs的增殖分化很大程度上在生长的微环境上,即有刺激神经干细胞分化所需要的物质,如神经因子,而且在移植的最早期分化比例较低,难以对移植本体局部的病理改变产生作用；神经营养因子是神经营养蛋白家族的重要成员,起到很关键的作用,为一种小的碱性蛋白质,是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质,其成员包括神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4(NT-4)等,这些蛋白质是治疗神经损伤等疾病的潜在药物标靶。其中神经营养因子-3(NT-3)是比较特殊的一种,在特定环境下,可以促进NSCs存活并起到早期分化的信号,是神经元分化及生长所必需的物质,NT-3联合NSCs移植似乎可以解决[11-15]。本实验主要方法是将神经干细胞联合神经营养因子3一起注入到鼠损伤侧大脑的侧脑室内,比较有无变化,尝试为临床上神经干细胞移植治疗新生儿缺血缺氧性脑病及后续治疗偏瘫、脊髓截瘫等神经损伤性疾病找到依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及动物分组60只出生后7 d健康WISTAR 乳鼠随机分为4 组:正常组:(n=15)；缺血缺氧模型组(n=15):结扎左侧颈总动脉,缺氧2 h；NSCs移植组(n=15):NSCs移植；Nt-3联合NSCs移植组(n=15):NT-3联合NSCs移植。

1.2 NSCs的制备及其鉴定将出生24 h内的乳鼠,75%酒精浸泡消毒,在显微镜下取出脑组织充分剪碎、吹打、离心；加入条件培养基DMEM/F12(Gibco,美国),bFGF(Protech,美国)20 ng/m L,EGF(Protech,美国)20 ng/m L约5 m L,置于37 ℃二氧化碳温箱内培养,待获得繁殖能力强的神经干细胞球,选取并种植于24孔培养板,加入有10%胎牛血清贴壁2 h后固定,nestin免疫荧光染色。

1.3 模型制备缺血缺氧模型[4]的建立,异氟醚麻醉,仰卧并固定,消毒,显微镜下解剖,颈部正中切开,左侧颈总动脉双结扎,离断,缝合切口。术后复苏2 h后,将小鼠置于37℃恒温密闭缺氧室。低氧室连续充入8%氧和92%氮的混合气体2 h,然后将小鼠置于笼中保温观察1 h,返回母鼠笼继续饲养。

1.4 平衡木试验将大鼠置于横杆开始处,测量其通过横杆进入暗箱所需要的时间,即潜伏期并记录后足滑脱次数。

1.5 NSCs及NT-3联合移植异氟醚麻醉成功后,在颅骨矢状缝左侧1 mm、冠状缝后方1 mm 处钻孔,放置立体定向头架,穿刺左侧侧脑室,使用微注射泵以0.5μL/min的速度将2μL 移植液(NSCs及NSC 与NT-3混合液)缓慢注入左侧侧侧脑室。注射后,保留针头2 min,然后取出。骨蜡封住骨膜,将头皮缝合后送回母鼠笼喂养。

1.6 脑标本制备移植后出生1个月时,用水合氯醛注射到鼠腹膜内麻醉,获得满意麻醉后,用剪刀剪开胸腔,见心脏搏动,一管从左心室进入主动脉弓,灌注,先用肝素化生理盐水灌注,后以福尔马林溶液灌注,至鼠四肢僵硬,眼球变白,灌注完毕。将鼠头剥除颅骨取出脑组织,在穿刺点前0.5 mm、后2.5 mm取出脑组织,用福尔马林液固定脑组织。

1.7 病理形态学免疫组化免疫组化GFAP胶质纤维酸性蛋白抗体(美国)、MBP髓磷脂碱性蛋白抗体(美国):切片,脱蜡至水；用蒸馏水冲洗,PBS 浸泡→高压抗原修复,切片滴加H2O2,室温30 ℃下甲醇封闭内源性过氧化物酶；PBS液洗后滴加一抗,4 ℃过夜；滴加二抗,滴入辣根酶标记的链霉素,DAB显色剂进行显色,苏木精复染,之后蒸馏水缓洗,使苏木精“蓝化”胞核呈蓝色；酒精脱水,晾干,滴加中性树胶加盖玻片封片,待晾干备用。观察切片脑室周围脑组织病理变化情况,在相同亮度、计数高倍镜下,每个观察点各连续3个不重叠视野的GFAP、MBP阳性细胞数,记录数据,并取平均值。

1.8 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行统计,计量资料采用均数±标准差表示,在符合方差齐性的条件下多组之间均数比较用单因素方差分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎鼠大脑源性神经干细胞的体外培养及鉴定在无菌环境中培养皮层组织,5～6 d后在培养基中观察,可见球形细胞团,形成单细胞悬液后进行nestin免疫组化染色,结果表明,神经球呈红色荧光,阳性,证实为NSCs,消化成神经干细胞单细胞悬液,继续培养等待移植。

2.2 平衡木行为学评价8只小鼠造模未成功,其中6只死于麻醉,2只未出神经损伤的迹象,造模未成功由多余模型成功鼠替代。正常组大鼠后肢活动自如,协调性好,能轻松通过横杆。模型组大鼠通过横杆时具有更多的探索性行为,犹豫不敢前进,后肢关节运动僵硬,协调能力差,后肢横杆经常脱落。与模型组相比,NSCs组和NT-3组后肢脱离次数减少,其中NT-3组恢复更加明显。

2.3 病理学、免疫组化

2.3.1 GFAP 染色:脑组织GFAP 染色:正常组可见组织结构整齐,可见少量GFAP 阳性细胞。模型对照组GFAP阳性细胞较正常组增多,脑组织结构紊乱,囊腔部分被包围,局部形成胶质结节。NSCs 移植组中大量GFAP 阳性细胞由脑室周围向白质迁移,结构较模型组略有改善。NT-3联合组仍可见相当数目的阳性细胞,并且细胞排列结构明显改善。高倍镜下更加明显观察细胞(红色箭头所指的为GFAP 阳性细胞,染色在胞浆呈棕黄色,核为蓝色)。见表1、图1。

2.3.2 MBP 染 色:脑 组 织MBP 染 色(4 周龄):正常组老鼠可见组织结构整齐,可见少量MBP阳性细胞。模型对照组,MBP 阳性细胞少见,细胞数目减少,并有空囊泡现象存在。NSCs组可见MBP 阳性细胞有所增多,结构较模型组稍改观。NT-3组可见MBP阳性细胞明显增多,细胞排列结构明显改善。高倍镜下更加明显观察细胞(红色箭头所指的为MBP阳性细胞,染色在胞浆呈棕黄或棕褐色,核为蓝色)。见表1、图2。

图1 免疫组化GFAP(×400) A：正常组；B：模型组；C：NSCs移植组；D：NT-3移植组Figure 1 Immunohistochemical GFAP(×400) A：Normal group，B：Model group，C：NSCs transplantation group，D：NT-3 transplantation group

图2 免疫组化MBP(×400) A：正常组；B：模型组；C：NSCs移植组；D：NT-3移植组Figure 2 Immunohistochemical MBP(×400) A：Normal group，B：Model group，C：NSCs transplantation group，D：NT-3 transplantation group

表1 GFAP、MBP染色各组阳性细胞数对比Table 1 Comparison of the number of positive cells in each GFAP,MBP staining group

表1 GFAP、MBP染色各组阳性细胞数对比Table 1 Comparison of the number of positive cells in each GFAP,MBP staining group

注:其他3组与正常组比较,a P＜0.05；NSCs组与HIBD 组比较,b P＞0.05；NT-3组与NSCs组比较,c P＜0.05；NSCs组与正常组比较,e P＜0.05；NSCs组与NT-3组比较,f P＜0.05；NT-3组与正常组比较,g P＞0.05

组别 n GFAP染色阳性细胞数 MBP染色阳性细胞数正常组 15 4.42±0.75 14.83±2.44 HIBD 模型组 15 22.25±6.01 3.13±0.39 NSCs移植组 15 25.46±3.96 7.04±0.93 NT-3联合组 1512.50±1.6612.87±1.19 P 1 ＜0.05a ＜0.05e P 2 0.794b ＜0.05 f P 3 0.013c 0.345g

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的病理学已证实其主要病变是OLs以及髓鞘的病变而引起的脑白质损伤[16-18]。大量少突神经胶质细胞缺失的直接后果是脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia,PVL),其特征分布的白质坏死,是脑室周围白质弥漫性或局灶性软化,提示PVL 是HIE 的重要病因[19-20],发病机制还不完全了解,因此很多实验研究围绕着脑白质损伤后改变,及相应的补充外来神经干细胞来进行。本课题组在3 a来的研究中发现,将神经干细胞移植到7日龄鼠HIBD 模型侧脑室内,神经干细胞可以存活且可以观察到迁移,移植后评估神经行为恢复情况也有改变[21-24]；但针对HIE 病理改变是OLs减少,单纯NSCs移植后不能定向分化,这是移植后结果并不理想的根本。本研究主要探讨了神经营养因子3对神经干细胞在定向分化方面上起的作用[25-26],并对大鼠的神经功能和形态学进行评价,为NSCs联合移植治疗HIE提供理论依据。

神经元是神经系统功能和结构的基本单位,是不可再生细胞,且是不可逆的,一般的神经细胞坏死,就会有相应的症状,并且无法重新生长,故一旦神经系统受损的话,尤其是重要神经元坏死,机体就会出现严重的后果。通过标记OLs及星型胶质细胞后,可以看到小鼠遭受缺血缺氧环境后,少突胶质细胞前体是最容易受到损伤,继而引起成熟OLs数量减少,髓鞘减少或合成延迟,胶质细胞反应性增生。缺氧缺血等多环境多机制(氧自由基、兴奋性氨基酸)等最终导致脑室周围白质的缺血缺氧损伤,形成PVL[27]。病理结果进一步证实了HIE的病理改变为PVL,进一步说明神经干细胞是缺血缺氧修复的靶细胞[28-30],与既往文献描述一致。本研究结果中MBP免疫组化方面,MBP 阳性细胞数分别为(3.13±0.39)个、(7.04±0.93)个、(12.87±1.19)个,统计学分析显示,NT-3组、NSCs组与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05),这也进一步说明NSCs侧脑室移植能分化为OLs,NT-3能诱导神经干细胞向OLs分化。

AS是中枢神经系统内多种胶质细胞中的一种[31],并且胶质细胞数目最多,是中枢神经系统中最主要的大胶质细胞,具有复杂而又精细的结构和功能,具体对缺氧高度敏感,易出现细胞死亡,也可再生,但这种再生是细胞修复,是应激反应,形成疤痕组织,无法恢复到原来的状态[32-33]。脑缺血缺氧后,产生氧化应激反应,兴奋性毒性,线粒体损伤导致胶质细胞异常活跃,AS 反应性活化,所以对神经元具有“双刃剑”的作用[34-35]。一方面,神经细胞损伤早期,AS 反应性增多,有利于瘢痕组织形成,为了保护机体应激性反应,大量AS促进NSCs及神经前体的分化[36]。另一方面瘢痕组织形成后,神经正常组织被瘢痕组织代替,永远失去其功能,周围细胞替代功能也不能实现。本课题中模型组GFAP阳性细胞明显增多,而随着神经干细胞植入后,GFAP 阳性细胞与模型组相比稍增多,分别为(22.25±6.01)个、(25.46±3.96)个；考虑为NSCs分化为AS所致,但无显著性差异。但NT-3组阳性细胞明显减少,差异有统计学意义。考虑到NT-3促进了NSCs向OLs的分化,但毕竟移植入脑的神经干细胞数量十分有限,因此转化为星新胶质细胞的数量减少。NT-3联合移植组在病理HE 染色后显示的瘢痕减少、病灶软化是一致的。本研究中行为能力项目中显示,移植后的小鼠可有较好行为能力,也说明损伤细胞有部分功能代偿,促进肢体恢复。

神经营养因子联合神经干细胞移植带来希望,改变NSCs的因子微环境对NSC 的激活有积极作用,给我们指明一个新的方向[37-43]。但目前只停留在动物实验阶段,临床报道很少,希望有一天能作为脑移植的供体、载体用于临床,将对小儿缺氧缺血性脑损伤这类疾病的治疗具有重大意义。