新生儿Rh溶血病与IgG1、IgG3相关性分析

高婉卿，郑必霞，杨 劲，李凌波，孙喜东

新生儿溶血病(hemolytic disease of newborn，HDN)是新生儿期最为常见的疾病之一，主要包括ABO溶血和Rh溶血两大类，前者约占85.8%，Rh溶血约占14.2%[1]。而临床中Rh-HDN较ABO溶血起病急，病情重，溶血程度重，病情发展迅速，患儿可在生后24 h内出现黄疸，并呈进行性加重，同时可有程度的贫血、心力衰竭和呼吸窘迫等，重者可导致核黄疸并造成核黄疸后遗症，严重影响患儿的生命健康[2-3]。因此，提高产前Rh-HDN诊断率，并积极进行产前预防和产后的及时治疗是降低患儿死亡率、致残率的关键。该研究对64例Rh-HDN患儿的血型进行筛选、鉴定，检测患儿IgG抗体亚型，并分析Rh-HDN与患儿不同IgG亚型的相关性以及不同制备抗体对Rh-HDN的影响，旨在为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例资料本研究病例均来自2014年6月～2018年6月合肥市第二人民医院儿科及南京市儿童医院收治的64例Rh-HDN患儿，患儿母亲产前抗体鉴定确定为Rh系统同种抗体。治疗纳入标准：① 患儿与母亲Rh血型不符；② 患儿出生后24 h内出现黄疸，并呈进行性加重；③ Coombs试验、游离抗体试验中至少一项为阳性；④ 均为单胎患儿。排除标准：① 诊断为ABO溶血的患儿；② 患儿合并先天性疾病；③ 合并心、肝、肾等实质性器官病变的患儿；④ 合并凝血功能障碍的患儿。64例患儿中，男38例，女26例；平均体质量(3.52±1.36 )kg；入院时间产后3～76 h，平均日龄1.6 d；自然分娩35例，剖宫产29例；母亲妊娠次数≤1次16例，>1次48例。本研究经合肥市第二人民医院及南京市儿童医院医学伦理委员会批准进行。

1.2 仪器与试剂筛选细胞、谱细胞、抗-C、抗-e、抗-E、抗-e、抗-IgG1、抗-IgG2、抗-IgG3、抗-IgG4均购自Sanquin公司；抗-D、Rh分型卡、LISS-Coombs卡、空白微柱凝胶卡均购自BIO-RAD公司。

1.3 检测方法

1.3.1Rh系统抗体检测 将准备好的不规则抗体筛检卡做好标记，将配好的筛检细胞或谱细胞悬液加入标好的微管中，各1滴(或50 μl)，并立即分别加入待测血清1滴(或50 μl)；将加样后的试剂卡在专用37 ℃孵育箱中孵育15 min；使用专用离心机离心5 min(900 r/min，2 min；1 500 r/min，3 min)，取出直接肉眼观察结果。所有操作均严格按照仪器与试剂盒说明书进行。

1.3.2直接Coombs试验、游离抗体试验 将患儿压积红细胞与适量红细胞稀释液混合配制成0.8%～1%的红细胞悬液，采取患儿外周静脉血置于无抗凝剂试管中，并于37 ℃下放置2 h，2 000 r/min离心10 min，取上清液(该上清液不得有絮状物或沉淀)。充分洗涤红细胞至少3次，取同体积洗涤后的压积血和6%牛血清白蛋白(或生理盐水)混匀，置于56 ℃孵育10 min，期间不断摇动，1 000 r/min离心2～3 min，取上清液，即放散液。直接Coombs试验、游离抗体试验均按照实验标准进行。

1.3.3IgG亚型检测 将IgG 1、2、3、4抗体加入到空白LISS-Coombs卡中，按直接Coombs试验方法检测患儿红细胞上包被的相应IgG亚型。所有操作均严格按照仪器与试剂盒说明书进行。

1.3.4血清胆红素检测 患儿血清总胆红素、间接胆红素水平采用贝克曼AU5800全自动生化分析仪进行检测。所有操作均严格按照仪器与试剂盒说明书进行。

1.4 观察指标① 患儿母亲Rh系统抗体筛查、鉴定以及患儿红细胞IgG抗体亚型检测结果；② 患儿直接Coombs试验、游离抗体试验结果；③ 不同Rh系统抗体组患儿血清总胆红素、间接胆红素水平。

1.5 诊断标准Rh-HDN诊断标准[1]：① 母婴Rh血型不合；② 新生儿出生后24 h内出现黄疸，并呈进行性加重；③ 新生儿溶血3项试验即直接Coombs试验、游离抗体检测、抗体释放试验中至少一项为阳性。

微柱凝胶法测定Rh系统抗体效价较传统方法(聚凝胺法、抗人球蛋白试管法)高出1～2个滴度，故抗体效价≥32时评价为有临床意义。

2 结果

2.1 患儿母亲Rh系统抗体筛查、鉴定以及患儿红细胞IgG抗体亚型检测结果Rh系统D、C、c、E、c 5种抗原对应的抗体均可导致新生儿Rh-HDN发病，以抗-D和抗-E最为常见，引起新生儿Rh-HDN发病的IgG抗体亚型主要包括IgG1(23例，35.94%)、IgG1、3(35例，54.68%)，另外，有2例患儿同时存在IgG1～3，1例同时存在IgG1～4，表明IgG2、IgG4也能通过胎盘并包被胎儿红细胞，见表1。

2.2 患儿直接Coombs试验、游离抗体试验结果患儿直接Coombs试验结果：均为阳性；患儿游离抗体试验结果：4例为阳性-/+，6例为阳性1+，33例为阳性2+，21例为阳性3+。

2.3 患儿不同IgG抗体亚型与其血清总胆红素、间接胆红素水平相关性分析IgG1、3组患儿血清总胆红素、间接胆红素平均水平明显高于IgG1或IgG3组(P<0.05)；分别以患儿血清总胆红素、间接胆红素水平作为因变量，以患儿不同IgG抗体亚型水平作为自变量行Pearson相关性分析，患儿IgG1水平与患儿血清总胆红素、间接胆红素水平呈显著正相关(P<0.05)；患儿IgG3水平与患儿血清总胆红素、间接胆红素水平无明显相关性(P>0.05)；患儿IgG1、3水平与患儿血清总胆红素、间接胆红素水平呈显著正相关(P<0.05)；见表2、3。

2.4 不同Rh系统抗体组患儿血清总胆红素、间接胆红素水平比较抗-D组患儿血清总胆红素、间接胆红素平均水平明显高于非抗-D组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

3 讨论

在HDN发病过程中，IgG抗体发挥了关键作用。IgG是人体免疫球蛋白之一，主要由脾、淋巴结中的浆细胞合成和分泌，以单体形式存在，是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%，其中40%～50%分布于血清中，其余分布在组织中[4-5]。根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，在血清中浓度IgG1>IgG2>IgG3>IgG4[6]。IgG在人体抗感染免疫尤其是再次免疫应答中发挥重要作用，包括激活补体经典途径，介导溶菌和细胞毒作用；介导ADCC效应；结合SPA；中和毒素和病毒等[7-8]。另外，IgG是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白，是胎儿免疫的重要组成部分。出生前，胎儿IgG主要来自母体，在孕前期22～28周间，胎儿血IgG浓度与母体血IgG浓度相等，出生后母体IgG逐渐减少，到第3、4月胎儿血IgG降至最低，随后胎儿逐渐开始合成IgG，血清IgG逐渐增加[9]。在HDN发病中，由于母体内产生了大量针对胎儿血型的IgG抗体，通过胎盘进入胎儿血液循环，并与胎儿红细胞表面抗原相结合，导致胎儿红细胞被吞噬、破裂，最终引起HDN。因此，分析不同IgG亚型与Rh血型系统新生儿溶血病的关系，检测Rh系统致病抗体，对预防和治疗Rh-HDN具有重要临床意义。

表1 患儿母亲Rh系统抗体筛查、鉴定以及患儿红细胞IgG抗体亚型检测[n(%)]

表2 不同IgG抗体亚型组患儿血清总胆红素、间接胆红素水平比较

表3 患儿不同IgG抗体亚型与其血清总胆红素、间接胆红素水平相关性分析

表4 不同Rh系统抗体组患儿血清总胆红素、间接胆红素水平比较

本研究就Rh血型系统新生儿溶血病与IgG1、IgG3的相关性及其致病抗体展开研究，结果显示：IgG1与IgG1、3血型抗体是引起Rh-HDN最主要的IgG亚型，而IgG3单独存在时较少引起Rh-HDN。通过Pearson相关性分析显示： Rh-HDN的病情与患儿IgG水平呈明显正相关，患儿IgG1与IgG1、3水平越高，其血清总胆红素和间接胆红素水平越高，病情越严重。国外报道1 ∶32 的抗体效价是胎儿溶血病严重程度的临界值，当母亲IgG抗体效价> 1 ∶32 时，需高度关注并严密监测胎儿溶血状况。本研究64例Rh-HDN患儿，出生时IgG抗体效价大多>1 ∶32，大部分患儿表现为中度以上溶血，与文献[7]报道形似。本研究24例患儿发生了宫内溶血，其IgG抗-D抗体效价平均>1 ∶1 024，但值得注意的是1例患儿IgG 抗-D抗体效价达1∶1 024但并没有发生宫内溶血，且出生时Apgar 评分为10分，可能是患儿母亲多次妊娠后，体内产生抗HLA抗体，阻止单核细胞与抗-D抗体致敏红细胞之间的结合，即母源性HLA抗体封闭了胎儿巨噬细胞的Fc受体，阻止了胎儿致敏红细胞的破坏。而当胎儿出生后，失去了母体HLA抗体的保护，高效价抗-D抗体使胎儿迅速发生严重的HDN。母亲Rh血型系统筛选、鉴定结果显示：导致新生儿Rh-HDN发病Rh系统血型抗体包括抗-D、抗-CD、抗-DE、抗-E、抗-cE、抗-C 、抗-Ce 抗-c、抗-e等，但主要以抗-D和抗-E为主要致病抗体，本研究中，抗-D占34.15%，抗-E占28.05%，与文献[10]报道相符。通过对比不同Rh系统血型抗体患儿血清胆红素水平发现，抗-D较其他Rh抗体引起的HDN严重，有研究显示，Rh血型系统多重抗体比单一抗体更易引起HDN，且症状更严重。目前，国外学者认为Rh抗体效价≥16有较大的临床意义，本研究采用微柱凝胶法与传统方法相比高出1～2个滴度，因此以Rh抗体效价≥32判断临界值。但本研究认为不论Rh抗体效价高低，只要母亲体内存在此抗体，特别是含有抗-D类的Rh抗体，临床都应警惕HDN的发生，如抗体效价伴随妊娠周龄的增加而不断升高，临床上应高度重视，产后婴儿应立即做HDN血清学检测，病情严重者应及早进行换血治疗。

综上所述，在Rh-HDN的临床预防和诊断中，不仅要加强对RhD抗原的检测，同时也不能忽略Rh其他类型抗原的检查的重要性，特别是对抗-E和抗-cE的检测。Rh血型系统抗体主要是IgG抗体，其中以IgG1和IgG1、3为主，并且Rh-HDN病情与IgG1和IgG1、3水平呈明显正相关关系，因此，临床应积极对产前孕妇体内IgG1、IgG3水平进行动态监测。另外，胎儿出生后，及时检测其IgG1、IgG3水平，有利于准确评估患儿病情，为患儿的治疗方案选择提供指导。