LukS-PV对乳腺癌细胞MAD-MB-231增殖、凋亡及细胞周期的影响

于文伟，许良飞，汪自然，强雅雯，马筱玲

在女性中，乳腺癌是最常见的肿瘤类型，也是世界上第二大常见的肿瘤[1]。三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)约占所有乳腺癌病例的10%～15%，它的病理特征是缺乏雌激素、孕激素和人类表皮生长因子三种受体[2]。由于TNBC恶性程度高,并且缺乏靶向治疗药物，导致其预后较差。目前临床的治疗手段有手术切除、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗，但是临床疗效不佳。所以急需新的有效并毒副作用小的靶向药物。

PV-杀白细胞素(panton-valentine leucocidin,PVL)是由金黄色葡萄球菌分泌，PVL含有S组分(LukS-PV)和F组分(LukF-PV)两种亚组分，课题组前期研究[3]表明LukS-PV能够在体内外诱导白血病细胞凋亡，且体内实验表明并没有明显的毒副作用，进一步研究显示LukS-PV是通过补体C5a的受体(C5a receptor, C5aR)发挥促凋亡作用[4]，结合C5aR在TNBC中高表达的文献报道[5]，由此可推测LukS-PV能够与高表达C5aR的TNBC细胞结合，发挥抗肿瘤效应。该研究采用TNBC细胞株MAD-MB-231研究LukS-PV对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，为其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂MAD-MB-231购自中科院上海细胞库；DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自南美Gemini公司；CCK-8试剂盒、胰酶、青-链霉素、BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；周期试剂盒、凋亡试剂盒购自美国BD公司；B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关的X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3)、Caspase-8、β-actin一抗购自美国CST公司；二抗购自武汉爱博太泰克生物科技公司；大肠杆菌BL21(DE3)重组表达载体pET28a-LukS-PV由本课题组构建并在-80 ℃冰箱保存。

1.2 仪器与设备超净工作台购自北京亚太科隆设备有限公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；细胞培养箱、多功能酶标仪购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；流式细胞仪购自美国BD公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 细胞培养MDA-MB-231细胞培养于含有10%的胎牛血清、1%链霉素和青霉素的高糖DMEM培养基中，放置在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。在细胞生长至80%左右融合度时，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤2次，加入1 ml胰酶直到细胞形态变圆，加入2 ml含10%血清的DMEM培养基，用枪头轻轻吹打混匀并按适宜比例进行传代。

图1 不同浓度LukS-PV对MAD-MB-231细胞形态学影响 ×200

1.4 LukS-PV的表达、纯化及定量按照常文娇 等[6]报道的方法对LukS-PV的表达、纯化，用BCA法检测蛋白浓度。

1.5 CCK-8检测细胞增殖细胞生长至对数生长期后，用胰酶消化并接种于96孔细胞培养板，每孔4×103个细胞，每组3个复孔，24 h后加入对应浓度的LukS-PV, 继续培养，分别在刺激后12、24、36 h每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h后，在450 nm波长下检测吸光度(optical density, OD)值。细胞增殖抑制率的计算方法为：增殖抑制率(%)=1-OD(实验组-空白组)/OD(对照组-空白组)×100%。

1.6 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡细胞生长至对数生长期后，用胰蛋白酶消化并混匀，以每孔2×105个细胞的浓度接种于6孔板中，培养1 h待细胞贴壁后，加入相应浓度的LukS-PV, 继续培养24 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用PBS洗涤2次，加入400 μl Annexin V 结合液重悬细胞，在避光条件下加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI,避光室温孵育15 min, 上机检测。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期当细胞在对数生长期后，用胰蛋白酶消化并混匀，以每孔2×105个细胞的密度铺于6孔板中，培养12 h待细胞贴壁后，加入相应浓度的LukS-PV, 继续培养24 h，用胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用PBS洗涤2次，在4 ℃条件下用70%乙醇过夜固定，并用PBS洗涤2次，加入0.5 ml的PI/RNase staining染液，避光室温孵育30 min，上机检测。

1.8 蛋白印记检测凋亡相关蛋白的表达LukS-PV刺激细胞24 h后，收集细胞，PBS洗涤2次，加入适量细胞蛋白提取试剂，冰上摇动30 min,用BCA法检测蛋白浓度。用12%或15%的SDS-PAGE胶进行电泳，转移至NC膜，结束后用5%的脱脂牛奶封闭2 h，分别放入以1 ∶1 000倍稀释的对应一抗，4 ℃孵育过夜，用PBST洗涤3次，每次10 min，然后放入以1 ∶10 000稀释的二抗中室温孵育1.5 h，结束后用PBST洗涤3次，每次10 min，最后加入发光液，并在凝胶成像系统中进行曝光。

2 结果

2.1 LukS-PV对MAD-MB-231形态学影响LukS-PV刺激MAD-MB-231细胞24 h后，显微镜下观察，PBS组细胞呈贴壁生长，形态清晰，大小均一，而随着LukS-PV浓度增加，细胞数量变少，细胞间隙增加，细胞变圆，悬浮细胞数量增多。见图1。

2.2 LukS-PV对MAD-MB-231增殖的影响用不同浓度的LukS-PV作用MAD-MB-231细胞12、24、36 h后，采用CCK-8法检测LukS-PV对MAD-MB-231增殖抑制率，结果表明，随着LukS-PV浓度的增加，对细胞增殖的抑制率越高，且对细胞的增殖抑制率随着作用时间延长而增加，表明LukS-PV对MAD-MB-231增殖的抑制作用是浓度-时间依赖性的。见图2。

图2 不同浓度LukS-PV对MAD-MB-231增殖的抑制作用

2.3 LukS-PV对MAD-MB-231细胞周期的影响用流式细胞仪检测细胞周期变化。在不同浓度的LukS-PV作用MAD-MB-231细胞36 h后，结果显示，细胞周期被阻滞在G1/G0期，且LukS-PV的浓度越高，阻滞在G1/G0期细胞越多(F=130.1，P<0.05)。见图3、表1。

图3 不同浓度LukS-PV对MAD-MB-231细胞周期分布的影响

图4 不同浓度LukS-PV对MAD-MB-231细胞凋亡的影响

表1 LukS-PV对MAD-MB-231细胞周期变化的影响

与 PBS组比较：*P<0.05

2.4 LukS-PV对MAD-MB-231细胞凋亡的影响不同浓度LukS-PV刺激MAD-MB-231细胞24 h后，流式结果显示，不同浓度LukS-PV(0.25、0.5、0.75、1 μmol/L)作用24 h后，凋亡率分别为(10.63±1.24)%、(16.45±1.49)%、(29.19±3.45)%、(58.10±2.15)%，与PBS组(5.40±1.15)%相比，LukS-PV能诱导MAD-MB-231细胞凋亡，呈浓度依赖性(F=298,P<0.05)。见图4。

2.5 LukS-PV对MAD-MB-231细胞凋亡相关蛋白表达的影响随着LukS-PV浓度增加，Bax、Cleved-caspase3、Cleved-caspase8表达增加，Bcl-2表达减少。见图5。

图5 不同浓度LukS-PV对凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

TNBC由于恶性程度高，缺乏有效的靶向治疗药物，导致患者预后较差，因此寻找高效低毒的靶向治疗药物是研究的热点。细菌毒素兼具与靶细胞结合的特异性与细胞毒性，能够靶向结合并杀伤靶细胞，起到抗肿瘤作用。研究[7-8]表明一些细菌毒素有很好的抗肿瘤效应，其中部分已用于临床治疗，例如，肉毒杆菌分泌的神经毒素，对前列腺癌、乳腺癌、神经母细胞癌具有良好的抑制作用，目前已经临床3期试验。白喉杆菌产生的白喉毒素对胶质瘤、宫颈癌、乳腺癌有很好的抗癌作用，目前已经进入临床2期试验[9-10]，另外，绿脓假单胞菌产生的外毒素和李斯特菌产生的溶血素[11]也显示了很好的抗癌作用。这表明细菌毒素具有广阔的应用前景。

本文研究的细菌毒素LukS-PV是金黄色葡萄球菌分泌的杀白细胞素PVL的双组分之一(LukS-PV和LukF-PV)，结果表明LukS-PV能够抑制MAD-MB-231增殖，使其周期阻滞在G0/G1期，研究结果与前期在白血病中研究[12]结果一致。细胞凋亡是细胞程序性细胞死亡，并且诱导癌细胞凋亡在抗肿瘤治疗中有重要意义，也是评价抗肿瘤药物药效的一个重要方面。本研究显示LukS-PV能够浓度依赖性诱导MAD-MB-231凋亡。线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径是凋亡的三条主要通路[13]。Bcl-2家族在线粒体凋亡通路中扮演者关键作用，课题组通过检测线粒体凋亡通路相关蛋白显示，LukS-PV能够上调Bax、Cleved-caspase3、Cleved-caspase8表达增加，下调Bcl-2表达，说明LukS-PV可能是通过激活线粒体通路而诱导MAD-MB-231凋亡。

课题组前期实验[4]表明LukS-PV是通过C5aR发挥抗白血病作用，近年研究[5]显示，C5aR在TNBC中的阳性率约为40%，且C5aR在癌旁组织中不表达，C5aR的高表达与肿瘤的大小、肿瘤分期呈正相关性，与5年生存率呈负相关性。所以根据以上研究，LukS-PV未来可能作为C5aR阳性的TNBC的靶向治疗药物。