骨膜去细胞生物支架在骨缺损小鼠体内的血管化机制

张学铭，陈俊豪，陈雷，李晓航，汪开诚，林琼琼，金可可

（1.温州医科大学 病理学与病理生理学教研室，浙江 温州 325035；2.University of Western Australia，Perth WA6009；3.温州医科大学附属第一医院 骨科，浙江 温州 325015；4.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；5.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 病理科，浙江 温州 325027）

骨缺损、骨不愈是临床上常见的骨科难治性疾病，近年来骨组织工程技术的不断发展为骨缺损的治疗提供了新的方法和理念，其基本原理是制备优良的支架材料以搭载合适的种子细胞及生物因子，完成目标区域的功能重建[1]。骨膜具有较强的成骨能力，在骨折愈合修复方面具有重要作用，被认为是促进骨移植材料在移植区域发挥修复作用的始动因素[2]。骨膜去细胞生物支架去除了具有免疫源性的细胞成分并基本保留了细胞外基质的三维空间结构和重要组分，在异体皮下包埋实验中展现出了良好的生物相容性[3]。研究表明支架材料是诱导种子细胞黏附、增殖、分化并维持功能的重要载体，其血管化是实现组织工程体外培养构建与体内移植的重要途径，是去细胞骨膜支架发挥生理功能的关键因素[4-5]。目前对于骨膜去细胞生物支架的血管化研究国内外罕见报道，因此本实验观察去细胞骨膜支架在小鼠股骨缺损模型中血管形成的作用及其对骨缺损的修复效果，并探讨其血管化的机制，以期为后续该支架应用于治疗骨缺损、骨不愈提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康6周龄雄性C57BL/6小鼠64只，体质量（23±3）g；健康4月龄雄性新西兰白兔30只，体质量（2.00±0.25）kg，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（浙）2015-0009。动物实验严格按照科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》执行。

1.2 主要试剂和仪器 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脱氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I，DNase 1，美国Sigma公司）；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、青霉素、链霉素（美国Sigma公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC，上海博谷生物科技有限公司）；Cell Counting Kit-8试剂盒（日本Dojindo公司）；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海西塘生物科技有限公司）；兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）IgG（美国Abcam公司）；山羊抗兔二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；Epoch 微孔板分光光度计（美国BioTek公司）；Nikon ECLIPSE 80i显微镜（日本Nikon公司）。

1.3 去细胞骨膜支架的制备 将游离的兔胫骨骨膜在-80 ℃下冷冻24 h后放于37.5 ℃水浴锅中1 h，往复5个循环；取出骨膜放入1% Triton-X100 和0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的脱细胞液中置于37 ℃恒温震荡机上震荡12 h，PBS反复冲洗；放入1% SDS中继续震荡2 h；冲洗后将骨膜放于混有50 U/mL DNase 1酶消化酶液中30 min后，浸泡于0.1%过氧乙酸溶液消毒1 h，PBS充分冲洗后置于含100 U/mL的青、链霉素的PBS液中4 ℃环境下保存备用。

1.4 支架浸提液的制备及VEGF测定 完全DMEM培养基浸泡支架72 h获得支架浸提液，用于VEGF测定。参照试剂盒说明书用ELISA法检测支架浸提液中VEGF水平。

1.5 骨膜去细胞支架浸提液细胞毒性检验 采用CCK-8法检测骨膜去细胞支架浸提液对骨膜细胞增殖的影响。细胞分为正常对照组和支架浸提液组。正常对照组中加入DMEM培养基[含10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素G和0.1 mg/mL链霉素）]；支架浸提液组加入等量含10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素G和0.1 mg/mL链霉素）的支架浸提液。将HUVEC分别以5×103细胞/孔和10×103细 胞/孔的浓度接种于96孔板中，在细胞培养箱中孵育。分别在第2天和第5天，用酶标仪在450 nm下测量细胞的吸光度，以上每组样本检测8个孔。

1.6 支架浸提液对HUVEC迁移的影响 采用细胞划痕实验观察HUVEC迁移。实验分为3组：①正常对照组；②支架浸提液组；③bFGF阳性对照组。正常对照组加入完全DMEM培养基，支架浸提液组加入等量的支架浸提液，阳性对照组中加入等量含5 ng/mL bFGF的DMEM培养基。HUVEC以5×105细胞/孔的浓度种在六孔板中，在含5% CO2的细胞培养箱中37 ℃过夜。使用灭菌的黄色枪头在孔板底部，垂直水平线划出痕迹，用PBS轻柔冲洗干净，将六孔板放入含5% CO2细胞培养箱在37 ℃孵育24 h。在0、12、24 h 拍摄照片，并使用ImageJ软件计算各组细胞的迁移面积。

1.7 动物实验 随机将C57BL/6 小鼠分为对照组（n=16）和支架组（n=48）。使用1.5%的戊巴比妥钠麻醉小鼠（0.1 mL/20 g）；用4G针头在小鼠股骨远端上制作直径0.5 mm的孔状单皮质缺损；将去细胞骨膜支架用打孔器制成直径5 mm的圆片，并消毒备用。对照组小鼠在孔状骨缺损制备完毕后，不放置任何材料，直接缝合肌肉和皮肤；支架组中，将消毒好的骨膜支架放置在股骨缺损处，适当固定后，缝合肌肉和皮肤。分别在第7天、第14天、第21天和第28天处死动物，取出股骨，4%多聚甲醛固定；37 ℃下用含12.5%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脱钙溶液脱钙。最后将骨膜支架进行石蜡包埋，切片备用。

1.8 去细胞骨膜支架的血管化观察 通过HE染色观察骨缺损区域和支架的修复情况。免疫荧光染色法观察血管上的vWF。实验步骤如下：石蜡切片厚度5 μm，常规脱蜡至水，并进行抗原修复；加入兔抗vWF抗体（1:100），4 ℃过夜；加入荧光标记的二抗抗体，37 ℃湿盒避光孵育30 min；4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）复染10 min，PBS冲洗5 min；甘油缓冲液封片；荧光显微镜下观察，胞核呈蓝色荧光，vWF的表达为绿色荧光。

1.9 统计学处理方法 采用SPSS22.0统计软件分析。计量资料行正态性检验，实验数据以±s表 示。组间比较采用单因素方差分析，多组样本的均数比较先行方差齐性检验，方差齐者两两比较行SNK-q检验，方差不齐者行Duunet’s检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 支架浸提液的细胞毒性 CCK-8法检测结果显示，在第2天和第5天，2种细胞浓度的支架浸提液组和正常对照组的OD值差异均无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 细胞毒性实验结果（n=8）

2.2 支架中VEGF的浓度 ELISA法检测结果显示，支架浸提液中的VEGF浓度为（210.75±4.81）pg/mL，高于正常对照组（完全DMEM培养基）的（21.00± 6.37）pg/mL，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 细胞划痕实验 实验结果显示支架浸提液组细胞的迁移面积大于正常对照组，但小于bFGF阳性对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 细胞划痕实验结果

2.4 支架的血管化观察

2.4.1 HE染色：去细胞骨膜支架植入体内7 d后，支架中有血管出现（见图3）；在第14天，支架内血管明显增多；第21天时，支架中血管密度达到最大，血管内可见少量红细胞；第28天时，血管密度较第21天有所下降。

2.4.2 免疫荧光染色：第7天的支架内出现绿色环状荧光，数量较少；第14天，荧光量有所增加，且较局部分散；第21天，荧光量明显增加，并且分布较均匀；第28天，荧光量较第21天时有所减少。提示支架内血管生长呈现先增多后减少的趋势，并于第21天的时间段内达到最高水平（见图3）。

图3 支架的HE染色和免疫荧光染色（比例尺：50 μm）

2.5 骨缺损区域的修复情况 第7天，支架组骨缺损处观察到肉芽组织和血管。在对照组中，骨缺损处仅观察到纤维结缔组织，未观察到血管。第14天，支架组骨缺损处血管密度增加，并且出现骨样矿化；对照组骨缺损处开始出现肉芽组织和血管。第21天，支架覆盖的缺损处编织骨形成，出现骨样结构，对照组可观察到骨样矿化，但没有编织骨形成。在第28 天，支架组骨缺损处皮质骨完整包裹缺损处，骨纤维排列较规则，骨缺损的愈合较完整，对照组可观察到骨样结构出现，纤维结构不规则。见图4。

3 讨论

图4 骨缺损处的HE染色（比例尺：100 μm）

本研究体外细胞实验发现，去细胞骨膜支架对HUVEC的增殖没有抑制作用，并且可以促进HUVEC的迁移，但是促迁移效果不如bFGF明显。bFGF可以促进HUVEC迁移[6]，故本实验中使用bFGF作为阳性对照组。有实验研究[7-8]将支架与bFGF结合来促进支架生理功能的恢复，并取得了良好的效果。在后续进一步的实验研究中，可以将bFGF和去细胞骨膜支架相结合，来增强支架的血管化，促进其修复能力的恢复。通过HE染色，我们观察到支架中血管的数量和分布随时间而呈现动态的变化。支架内血管数量随着在体内时间的延长呈先增多后减少的趋势，在第3周时支架内血管密度达到最大，血管分布也更加均匀。vWF是一种黏着性多聚糖蛋白，主要表达于血管内皮细胞表面[9]，故本实验通过vWF特异性荧光染色来进一步鉴定支架中的血管生成情况。免疫荧光检测到vWF的密度变化与HE染色中血管密度的变化呈现相同的趋势。去细胞骨膜支架中血管在后期减少提示支架在体内完成修复作用后，可能会逐步降解。在去细胞肌腱[10]和去细胞肾支架[11]的研究中均观察到支架降解过程，其具体降解机制需要进一步的实验研究观察。在骨膜支架的浸提液中检测到VEGF，提示支架的血管化机制可能是VEGF的刺激作用。VEGF在血管的生成和生长中起关键作 用[12]，其可以刺激内皮细胞的存活、增殖、分化和运动，促进血管的增多和生长[13]，并有研究表明，其可以增强骨形态发生蛋白的诱导作用，促进新生骨的形成[14]。

通过4个不同时间点对支架组和对照组的小鼠骨缺损区域的修复情况的对比观察，我们发现支架组小鼠的骨缺损处能够在更短的时间内出现血管，并长出排列规则的皮质骨。支架对骨缺损的修复作用，一方面是因为支架本身对缺损区域的覆盖保护作用，另一方面可能是支架内血管为骨缺损的修复提供了良好的氧和营养供应，并促进骨缺损区域的血管生成。

我们的实验结果表明去细胞骨膜支架可以血管化，并促进骨缺损的修复，其血管化的关键因素可能是VEGF。此外，实验中观察到支架中血管密度呈现先增多后减少的趋势，提示支架在完成修复功能后可能会发生降解，其机制有待进一步的研究和观察。