一种新型纤维蛋白原β链错义突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症

朱丽青，张海月，罗莎莎，方薇薇，刘斯奇，苏看看，杨丽红，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

遗传性纤维蛋白原缺陷症（congenital fibrinogen deficiency，CFD）是一种少见的出血性疾病，分为I型和II型2 种类型。I型患者血浆中纤维蛋白原（fibrinogen，Fg）数量减少，包括低纤维蛋白原血症和无纤维蛋白原血症；II型患者血浆中Fg数量正常，但出现功能缺陷，主要包括异常纤维蛋白原血症和异常低纤维蛋白原血症[1]。基因突变是导致CFD的分子基础，可发生于Fg Aα链、Bβ链和γ链，突变类型包括错义突变、移码突变、无义突变及大片段缺失等[2]。本研究对1例遗传性低纤维蛋白原血症进行了表型检测和基因分析，并且运用Swiss-PdbViewer等生物信息学工具对突变进行预测分析，初步探讨引起遗传性低纤维蛋白原血症的机制。

1 对象和方法

1.1 对象

1.1.1 病例资料：先证者，女，30岁，此次因乳腺小叶增生来温州医科大学附属第一医院就诊。术前常规凝血功能检查发现凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和凝血酶时间（thrombin time，TT）轻度延长，纤维蛋白原活性（fibrinogen activity，Fg:C）和血浆纤维蛋白原的抗原（fibrinogen antigen，Fg:Ag）明显降低，分别为0.82 g/L和1.19 g/L，其他凝血指标均无明显异常，肝肾功能正常。患者无诉鼻衄、出血难止、自发性出血等症状，亦无血栓病史。该家系的系谱图见图1。

图1 遗传性低纤维蛋白原血症家系图

1.1.2 正常对照：选取我院体检中心150名健康体检者为正常对照，用以排除基因多态性。其中男78名，女72名，年龄26～59（38.6±24.8）岁。健康对照确认无肝肾功能疾病，无出血与血栓史，采样前均已知情同意。

1.2 方法

1.2.1 仪器：STA-R全自动凝血功能分析仪（法国STAGO公司）、Beckman Coulter LX20PRO全自动生化分析仪（美国Beckman公司）、PCR扩增仪（ABI Thermal cycler 2720，美国ABI公司）、凝胶电泳仪（上海BIO-RAD公司）、凝胶成像系统（上海天能公司）。

1.2.2 引物：共包括29对引物（由上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科王学锋教授馈赠）[3]，覆盖了纤维蛋白原基因FGA、FGB、FGG所有外显子及侧翼序列和启动子区，其基因序列分别为：GenBank M64982、M64983、M10014。

1.2.3 试剂：常规凝血项目试剂盒为法国STAGO公司原装配套试剂，Fg:Ag检测试剂盒购自浙江伊利康生物技术有限公司，血液基因组DNA提取试剂盒及PCR扩增试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2.4 样本采集：本研究已通过本院伦理委员会批准，并已签订先证者及其家系成员的知情同意书。共采集该家系2代6名成员及正常对照组的外周血标本，用109 mmol/L枸橼酸钠以1:9抗凝，3 000 r/min离心10 min后，上层血浆于2 h内进行凝血指标检测；下层血细胞-40 ℃冻存，用于DNA抽提。

1.2.5 凝血项目分析：在Stago-R全自动血凝仪上检测活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、PT、TT、Fg:C、D-二聚体（D-dimer，D-D）和纤维蛋白（原）降解产物 （fibrinogen degradation product，FDP）；Beckman Coulter LX20全自动生化分析仪上检测Fg:Ag。

1.2.6 Fg突变位点筛查：用全血DNA抽提试剂盒提取先证者及其家系成员外周血DNA。PCR法扩增先证者FGA、FGB、FGG基因所有外显子及侧翼序列和启动子区。PCR反应总体积为50 μL，包括PCR Master Mix 25 μL、双蒸水18 μL、DNA模板3 μL和上下游引物各2 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min； 94 ℃ 30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min； 30个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送上海桑尼生物科技有限公司测序分析（所用测序仪为ABI PRISM 3730）。测序结果用Chromas软件与GeneBank中的相应序列进行比对（M64982、M64983、M10014），并对150名健康对照者进行该位点检测，以排除基因多态性的可能。

1.2.7 生物信息学分析：基于已知的Fg结构模型（http://www.rcsb.org/pdb，PDB ID:1FZA），分别用Swiss-PDViewer、在线分析系统（http://www.uniprot.org/align）对突变蛋白的结构、突变位点的保守性进行预测分析。

2 结果

2.1 凝血指标检测 先证者PT和TT均轻度延长，Fg:C和Fg:Ag明显降低。先证者父亲和儿子的Fg:C和Fg:Ag也均有不同程度降低，TT也延长，他们的D-D和FDP均在正常范围；其他家系成员的Fg:C、Fg:Ag及相关凝血指标均在正常范围（见表1）。

2.2 基因检测 先证者FGB基因发现第3外显子存在c.425T＞G杂合突变（见图2），导致Fg第121位亮氨酸被替换为精氨酸（Leu121Arg）。通过分析其家系成员，发现其父亲和儿子FGB基因也携带有c.425T＞G杂合突变。针对该突变位点，我们对150名健康体检者的相应位点进行筛查，均未发现该突变，排除了基因多态性的可能性。检索突变数据库（http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen）及查阅文献显示：该突变类型为国际上尚未见报道的新突变。

表1 先证者及其家系成员凝血指标及表型检测结果

图2 纤维蛋白原FGB 基因第3外显子的测序结果

2.3 Fg Leu121Arg突变蛋白的模型预测分析 Leu121 位于FgBβ链三股螺旋的初始部位，紧挨着卷曲螺旋结构域，为非极性疏水氨基酸，当突变为Arg后，改变了氨基酸的极性。Swiss-PDViewer模型预测分析发现，当Leu121突变为Arg后，在Arg121和Try117、Met118、Trp125之间新增了氢键（见图3）。ClustalX-2.1-win软件蛋白同源性分析发现：Leu121在小鼠、人类、黑猩猩、犬、牛等多种脊椎动物间有较高的保守性（见表2）。

3 讨论

图3 Leu121Arg突变模型分析

Fg又称为凝血因子I，由Aα、Bβ、γ 3条多肽链构成，是血浆中含量最高的凝血因子，在凝血和止血过程中均起到了非常重要的作用。Fg的3条多肽链以对称性二聚体（Aα、Bβ、γ）2的形式存在，分别由FGA、FGB、FGG3个独立的基因编码[4]。这3个基因的缺陷可导致Fg含量或（和）功能异常，分别导致遗传性无纤维蛋白原血症、遗传性低纤维蛋白原血症、遗传性异常纤维蛋白原血症及遗传性异常低纤维蛋白原血症[5]。目前已报道的位于Fg基因（FGA、FGB和FGG）的突变类型共有300余种，包括错义突变、无义突变、剪切突变以及移码突变。这些突变主要发生在Aα链上，其次为γ链，而Bβ链最为少见。查阅突变数据库（HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php），到目前为止，发生在Bβ链上的突变类型仅报道有97种，大都位于Bβ链的C端[6]。

本研究中，我们发现1例位于β链三股螺旋初始部位的Leu121Arg错义突变，引起遗传性低纤维蛋白原血症：先证者Fg:C和Fg:Ag分别为0.82 g/L和1.19 g/L，其父亲和儿子的Fg:C和Fg:Ag也明显降低。基因分析发现：他们在FGB基因第3外显子的425位均有T＞G杂合突变，导致Leu121Arg错义突变。蛋白同源性分析显示：Leu121在脊椎动物中有较高的保守性，提示该位点对于Fg正常结构和功能非常重要。Leu121Arg突变，有可能影响了Fg的结构，导致蛋白稳定性下降。此外，PDViewer蛋白预测分析软件发现：非极性疏水氨基酸Leu121突变为极性氨基酸Arg121，一方面改变了氨基酸的疏水性；另一方面，导致Arg121和Try117、Met118、Trp125之间新增了氢键。因而，该突变有可能影响了突变蛋白的二级结构，导致其折叠、构象及稳定性改变，引起血浆Fg水平降低。

查阅文献和检索Fg基因突变数据库（http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen）发现，Leu121Arg为首次发现的新突变。Leu121位于Fg Bβ链三股螺旋的初始部位，紧挨Bβ链的卷曲螺旋结构域。以往研究表明：Bβ链的合成被认为是Fg合成组装的限速步骤[6-7]。其中，卷曲螺旋结构域对于Fg Aα、Bβ、γ链的正常组装至关重要[8]；而C端则与Fg分泌密切相关[6]。HANSS等[9]曾报道1例由Fg Met118Lys突变引起的低纤维蛋白原血症，该突变因为改变了氨基酸极性，导致Fg分子构像发生改变，先证者伴有出血表现及流产病史。Leu121邻近Met118，两者均位于Bβ链毗邻卷曲螺旋结构域的区域，因此，我们推测，Leu121Arg突变也有可能通过影响该结构域的稳定性，导致Fg的组装异常，引起低纤维蛋白原血症。

综上所述，本研究发现了一个位于B β 链Leu121Arg错义突变引起的遗传性低纤维蛋白原血症家系，该突变可能通过改变氨基酸极性，影响氢键形成等影响突变体的稳定性，导致遗传性低纤维蛋白原血症。其具体机制有待进一步的体外表达研究。

表2 蛋白同源性分析结果