和厚朴酚通过UbcH8诱导AML1-ETO蛋白降解

李海英，周斌，吴建波，邢冲云

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.中心实验室；2.血液内科）

AML1-ETO易位是急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）中最常见的染色体异常之一。由此产生的AML1-ETO融合蛋白由野生型AML1蛋白的NH2末端部分和几乎整个ETO蛋白质序列组成，AML1-ETO通过抑制正常的AML1功能在白血病转化中发挥起始和关键性作用[1]。AML1-ETO与其他基因突变如CEBPA[2]、c-kit[3]或RTK[4]协同迅速诱导白血病的发生。

和厚朴酚（Honokiol，HNK）是一种从植物厚朴的茎和皮中分离得到的天然酚类化合物[5]，能通过靶向多种信号传导分子包括Wnt1-β-catenin[6]、JAK2/STAT3[7-8]和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）[9]，发挥抗肿瘤和抗血管生成活性。我们已经报道过HNK对AML有治疗作用[10]，并在前期实验中发现HNK能引起AML1-ETO蛋白的降解。本实验旨在研究HNK降解AML1-ETO蛋白的可能机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养 人AML1-ETO+白血病细胞株Kasumi-1 购自ATCC，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中。分别将10、20、40 μmol/L HNK加入细胞上清液中，待24 h和48 h后提取mRNA和蛋白。10 μg/mL放线菌酮（美国Sigma公司）分别加入含或不含40 μmol/L HNK的Kasumi-1细胞中，于0、4、8、12、16、24 h提取蛋白进行检测。

1.2 Western blot检测相关蛋白的表达 相关抗体包括AML1（美国CST公司）、ETO（美国Santa Cruz Bio-technology公司）、UbcH8（美国Abcam公司）、β-actin（德国Merck Millipore公司）。按标准流程操作，在Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像系统上拍照，使用Quantity One分析软件分析灰度值。

1.3 mRNA的提取和实时定量PCR（qRT-PCR） TRIzol 法提取总RNA，用反转录试剂盒（美国Fermentas公司）合成cDNA，用AML1-ETO和UbcH8上下游引物PCR扩增，以GAPDH为内参，SYBR Green荧光染料法相对定量，使用ABI7500荧光定量PCR仪检测。引物由上海生工合成，序列见表1。

1.4 基因芯片分析 从40 μmol/L HNK处理24 h的Kasumi-1细胞中提取总RNA，通过Super Script II 反转录酶（美国Invitrogen公司）将总RNA转化为cDNA并扩增，将cDNA杂交到人基因芯片3’IVT表达试剂盒（美国Affymetrix公司）上。使用PartekGS6.5 软件包（美国Affymetrix公司）进行分位数标准化和随后的数据处理。由阵列表示的所有基因在特定产物的熔解曲线上显示单峰。使用由制造商提供的基于Excel的PCR阵列数据分析软件来分析基因表达。基因科技（上海）股份有限公司完成了基因芯片分析。

表1 引物序列

1.5 质粒的构建 为了产生UbcH8（UBE2L6；NM_ 004223）过表达质粒，通过PCR扩增人UbcH8编码序列，然后将其克隆到反转录病毒载体pMSCV-puro（美国Clontech公司）中。设计针对UbcH8的基因特异性短发夹RNA（shRNA），并将其克隆到反转录病毒载体pSIREN-RetroQ（美国Clontech公司）中。所有质粒构建的引物序列如表1所示。

1.6 包装反转录病毒和细胞转染 将HEK-293T细胞（4×106）铺在10 cm培养皿中。24 h后，用包装质粒Gap-pol和VSV-G载体将MSCV-puro-UbcH8、MSCV-puro-AML1-ETO、pSIREN-UbcH8或阴性对照载体共转染到HEK-293T细胞中。转染48 h后从上清液中收集病毒，并进一步通过0.45 μmol/L滤器（德国Merck公司）过滤。将白血病细胞（2×105/mL）悬浮于含有8 μg/mL polybrene（美国Sigma公司）的病毒上清液中并以2 000 r/min离心2 h。嘌呤霉素 2 μg/mL（美国MCE公司）加入到上清液中1周以选择阳性克隆。

1.7 t（8；21）白血病小鼠模型 从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买雄性无胸腺裸鼠和C57BL/6小鼠（4周龄），动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002，并将其放置在垫料笼中，12 h光暗循环，可用的食物和水。对于裸鼠的异种移植模型，将1×107个Kasumi-1细胞与高浓度的Matrigel基质胶（美国BD公司）1:1比例混合，皮下注射到每只裸鼠的右侧。2周后，将小鼠随机分为2组。1组小鼠（n=5）每周3次腹膜内注射溶于20%脂肪乳剂的HNK（3 mg/d）；另1组小鼠（n=5）接受等体积的脂肪乳剂，并作为对照组。当肿瘤细胞接种6周后，处死小鼠，实验终止，收集每只小鼠的肿瘤组织。记录肿瘤体积。使用等式V（inmm3）=A×B2/2来测量肿瘤体积，其中A是最大直径，B是垂直直径。所有组的肿瘤组织迅速在液氮中冷冻备用。

1.8 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件。计量资料两两比较用独立样本t检验，多组比较用单因素方差分析，不同时间2组间比较用重复测量资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNK诱导AML1-ETO蛋白的降解 将携带内源性AML1-ETO的Kasumi-1细胞分别用10、20和40 μmol/L HNK处理不同的时间，Western blot检测结果表明，HNK能减少Kasumi-1细胞中的AML1-ETO融合蛋白，并且具有浓度和时间依赖性（见图1A-C）；然而，HNK并没有改变Kasumi-1细胞中的AML1-ETO mRNA表达水平（见图1D）。将Kasumi-1细胞用含有或不含HNK的蛋白质合成抑制剂放线菌酮处理不同时间，结果发现，HNK处理的Kasumi-1细胞中AML1-ETO蛋白的半衰期明显短于未处理的细胞（见图1E），表明HNK处理后AML1-ETO蛋白的稳定性变低。

图1 HNK诱导的AML1-ETO降解

2.2 通过基因芯片分析寻找目标基因 使用基因芯片分析来比较HNK处理前后的Kasumi-1细胞中mRNA表达，结果表明，HNK增加了1 168个不同的基因（＞2倍）和降低了212个不同的基因（＜2倍）（见图2A-B），其中UbcH8（一种E2结合酶[11]）表达提高了约4倍（见图2C）。

2.3 UbcH8在HNK诱导的AML1-ETO蛋白降解中的作用 将Kasumi-1细胞用40 μmol/L HNK处理24 h和48 h，HNK显著增加Kasumi-1细胞中UbcH8的mRNA和蛋白表达（P＜0.05），见图3A-B。用反转录病毒MSCV-UbcH8转染Kasumi-1细胞，使Kasumi-1细胞中的UbcH8过表达，实验结果显示，UbcH8的过度表达有效地诱导了AML1-ETO的降解（见图3C）。UbcH8被特定的shRNA敲除后，在Kasumi-1细胞中，2个独立的shRNA有效地降低了UbcH8蛋白的表达（见图3D）。此外，稳定敲除UbcH8的Kasumi-1细胞用HNK处理，结果表明，敲除UbcH8后HNK对AML1-ETO蛋白的降解被阻断（见图3E）。

2.4 HNK在Kasumi-1异种移植小鼠模型中的作用 HNK处理的小鼠中的肿瘤体积显著小于对照小鼠中的肿瘤，见图4A。与对照小鼠相比，HNK处理后小鼠的肿瘤生长速度显著降低，见图4B。与对照小鼠相比，用HNK处理过的小鼠获得的肿瘤中AML1-ETO的蛋白质水平显著降低，UbcH8表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4C。

图2 基因芯片分析结果

3 讨论

t（8；21）易位产生AML1-ETO蛋白，它能抑制普通AML1蛋白的功能，导致造血细胞生物学特性改变，从而在白血病的转化过程中起到关键作用[12-14]。 转基因小鼠研究显示，单独AML1-ETO基因表达并不能诱发白血病，AML1-ETO联合其他致癌基因如WT1（Wilm’s tumor-1）、KRAS等快速诱导转基因小鼠白血病[15-16]。进一步研究发现AML1-ETO联合低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）增强白血病细胞增殖，促进小鼠白血病发生发展[17]。这些研究结果提示：t（8；21）易位阳性的M2型AML的发生是在AML1-ETO融合蛋白的基础上需要联合其他遗传学改变，也就是所谓的“二次打击”，共同作用，最终引发白血病。

HNK是从植物厚朴的干皮、根及树叶中提取的中药单体，最近研究结果显示HNK对乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、口腔鳞癌等有很好的疗效[18-22]。我们已经报道过HNK可以诱导AML细胞周期停滞和凋亡，但对正常的造血干细胞没有影响[10]。我们又在前期实验中发现HNK能够降解白血病细胞中的AML1-ETO蛋白，因此我们进一步研究了HNK降解AML1-ETO蛋白的可能机制。

我们在实验中发现，HNK对AML1-ETO的降解具有时间和浓度依赖性，时间越长，浓度越高，Kasumi-1 细胞中AML1-ETO蛋白量越低；但是HNK并没有影响AML1-ETO mRNA的表达，说明其对AML1-ETO的调控是在转录之后。我们将HNK加入CHX处理后的Kasumi-1细胞，发现AML1-ETO蛋白半衰期变短，也说明HNK对AML1-ETO的调控是在蛋白层面上。

图3 UbcH8在HNK诱导的AML1-ETO降解中的作用

图4 HNK在裸鼠Kasumi-1异种移植模型中的抗肿瘤作用

我们又通过基因芯片分析寻找到UbcH8，发现HNK能增加它的表达，qRT-PCR和Western blot结果也证明了这一点。UbcH8是一种E2结合酶，能催化泛素与蛋白底物结合，使泛素活化，从而导致底物被蛋白酶降解。有文献报道，UbcH8能介导AML1-ETO蛋白的降解[23]，因此我们猜测UbcH8在HNK降解AML1-ETO过程中起到关键作用。

为了证明UbcH8的作用，我们用反转录病毒转染Kasumi-1细胞，使UbcH8过表达，结果AML1-ETO蛋白减少；而在稳定敲除了UbcH8的Kasumi-1细胞中，即使加入HNK，也不能引起AML1-ETO蛋白表达的下降，说明HNK对AML1-ETO蛋白的降解正是通过UbcH8来介导的。我们猜测，HNK可能是通过泛素-蛋白酶体系来降解AML1-ETO蛋白，UbcH8在其中起关键作用。其具体的作用机制，将是我们后续实验的重点。

最后，我们构建了异种移植小鼠模型，经过HNK处理的小鼠肿瘤体积小于对照组，肿瘤生长速度也下降，从HNK处理的小鼠体内获得的肿瘤中提取蛋白，检测发现AML1-ETO蛋白下降，而UbcH8升高。这证明了HNK具有成为临床治疗t（8；21）白血病患者药物的可能。

已经证明消除白血病发生的起始因素是非常有效的治疗策略。例如，用于慢性髓细胞白血病的BCR-ABL的药物格列卫[24]，用于t（15；17）的急性早幼粒细胞白血病中的PML-RARa的全反式维甲 酸[25-26]已经在治疗白血病中取得了重大的进展。但是，到目前为止还没有专门针对AML1-ETO融合蛋白的药物用于临床治疗。作为一种中草药中提取的天然化合物，HNK能有效地降解AML1-ETO蛋白，有可能为临床治疗t（8；21）白血病提供帮助。