高效液相色谱法测定可溶微针贴片中维生素C的含量

赵伟曼,吕慧娟,杨伟汉,董智勇,李莹莹,郑利洁,王清清

(蚌埠医学院药学院药物分析教研室,蚌埠 233000;*通讯作者,E-mail:candywqq@163.com)

可溶微针贴片(dissolving microneedles array,DMNA)是由水溶性材料和药物混合制成[1],有几十至几百个微针以阵列形式排布,应用于皮肤,既可以穿刺深度角质层,促进药物渗透,又能通过调节尺寸,避开感觉神经末梢以及血管,避免感染及疼痛[2]。近年来,可溶微针贴片作为一种新型透皮给药剂型,受到广泛关注[3,4]。目前关于可溶微针贴片的研究多集中在蛋白质、多肽、疫苗等大分子药物,而小分子药物的研究较少。

维生素C又名L-抗坏血酸,因其存在烯二醇结构而具有很强的还原性,可作为抗氧化剂,有效抑制酪氨酸酶,改善肌肤暗沉,如今被广泛用于美白化妆品中。本实验室前期研究美白可溶微针贴片,选择透明质酸和聚乙烯基吡咯烷酮作为制针辅料,采用两步注模干燥法制备维生素C美白可溶微针贴片[5]。

维生素C的常用定量分析方法包括传统的容量分析法(2,6-二氯靛酚钠法和碘量法)、光谱法、电化学法和色谱法[6]。由于可溶微针贴片中还存在其他辅料,且药物含量较低,所以本文采用高效液相色谱法(HPLC)测定可溶微针贴片中维生素C的含量,通过方法学验证,保证其准确可靠,为该种新剂型的质量研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

LC-16高效液相色谱仪(日本岛津)；XP 205型十万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；Advantage A10纯水仪(美国Milli-Q公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析)；Muitifuge X1R高速冷冻离心机(赛默飞科技公司)。

1.2 试药

可溶微针贴片(本实验室自制);维生素C对照品(上海麦克林生化科技有限公司,批号:201425,纯度>99.0%);透明质酸(hyaluronic acid,HA,华熙福瑞达生物医药有限公司,批号:1506165);聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP K90,德国BASF,批号:L96014768E0);水为超纯水;乙腈为色谱纯,冰醋酸为分析纯,均购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制备 维生素C对照溶液：精密称取维生素C对照品11.60 mg,用超纯水与冰醋酸(98.9 ∶1.1)配制成116 μg/ml储备液,并稀释成适宜浓度的对照品溶液。

制针辅料溶液：分别精密称取HA 0.025 1 g,PVP K90各25 mg,用超纯水配制成1 mg/ml可溶微针制针辅料储备液,并稀释成适宜浓度的HA和PVP K90溶液。

供试品溶液：参考文献[7],用刀片将微针针部取下来,溶于1 ml水中,作为供试品溶液。

1.3.2 色谱条件 色谱柱:Luna C18100A柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-水-冰醋酸(10 ∶89 ∶1);流速:0.6 ml/min;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μl。

2 结果

2.1 专属性试验

取1.3.1项下制备的4种溶液(维生素C对照品、HA、PVP K90、供试品溶液),按照1.3.2项色谱条件进样分析,制针辅料溶液色谱图在与维生素C对照品溶液色谱相应的位置上无色谱峰出现,表明在此色谱条件下,制针辅料对维生素C含量测定无干扰(见图1)。

图1 PVP K90、HA、Vitamin C、DMNA的专属性试验色谱图Figure 1 Specificity chromatograms of PVP K90,HA,vitamin C,DMNA

2.2 线性试验

精密吸取2.1.1制备的维生素C对照品储备液0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,5.0,8.0,10 ml,分别置于10 ml容量瓶中,用纯水与冰醋酸(98.9 ∶1.1)定容,得到浓度为2.32,5.80,11.60,17.40,23.20,34.80,58.00,92.80,116.00 μg/ml的一系列维生素C标准工作液。进入高效液相色谱仪分析,以维生素C浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,线性回归方程为:Y=88 754X-188 466(R2=0.999 0)。结果表明,维生素C在2.32-116 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系(见图2)。

图2 维生素C标准曲线Figure 2 The calibration curve of vitamin C

2.3 精密度试验

2.3.1 日内精密度试验 取浓度为5.8,34.8,92.8 μg/ml的维生素C标准工作液,依法连续进样3次,记录峰面积(见表1),3个浓度的日内精密度RSD均小于2%,平均RSD值为0.7%。表明本实验建立的方法日内精密度较好。

表1 维生素C的日内精密度

Table 1 Intraday precision of vitamin C

浓度(μg/ml)峰面积x±sRSD(%)平均RSD(%)5.8422812420860±1755.10.40.742035641941234.825387622577811±33820.41.32597810259686092.888741638901928±44048.10.589527178878905

2.3.2 日间精密度试验 取浓度为5.8,34.8,92.8 μg/ml的维生素C标准工作液,依法连续3 d进样,记录峰面积(见表2),3个浓度的日间精密度RSD均小于1%,平均RSD值为0.6%。表明本实验建立的方法日间精密度较好。

表2 维生素C的日间精密度

Table 2 Interday precision of vitamin C

浓度(μg/ml)峰面积x±sRSD(%)平均RSD(%)5.8420860423330±3017.80.70.642669442243734.825778112589185±11161.40.42600121258962292.889019288956275±48006.70.589929068973991

2.4 加样回收率试验

取2.1项下的维生素C、HA和PVP K90储备液,参考前期研究[7]配制药物辅料混合液,药物辅料浓度比为1 ∶5,1 ∶10和1 ∶20。维生素C浓度分别为46.4，23.2，11.6 μg/ml,药物辅料混合液注入高效液相色谱仪进样分析,记录峰面积,带入回归方程计算浓度,维生素C的平均回收率在99.8%-111.3%之间,RSD值小于2%(见表3)。

表3 维生素C加样回收率试验结果

Table 3 Results of recovery test of vitamin C

加入浓度(μg/ml)测得浓度(μg/ml)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)11.613.07112.7111.31.012.83110.612.84110.723.222.8898.699.81.423.1099.623.51101.346.450.01107.8106.41.348.85105.349.29106.2

2.5 重复性试验

取6片同一批制备的维生素C可溶微针贴片,按照2.1.3项分别制备成供试品溶液,进样分析,计算每片微针贴片针部维生素C载药量,可溶微针贴片中维生素C的平均载药量为64.91 μg,RSD为0.9%(n=6),表明方法重复性良好。

2.6 稳定性考察

取2.5项下某一供试品溶液,分别于1,2,4,8,12,24 h进样,记录维生素C峰面积,峰面积RSD为3.4%(n=6),表明维生素C供试品溶液在24 h内较稳定。

3 讨论

现行的2015版《中国药典》采用碘量法控制维生素C的含量[8],目前也有关于紫外可见分光光度法和高效液相色谱法测定维生素C含量的研究[9]。前期实验采用紫外可见分光光度计对维生素C对照品溶液和辅料溶液进行200-800 nm全光谱扫描,结果发现维生素C在254 nm处有最大吸收,且专属性良好,故检测波长选择254 nm。参考文献报道的色谱条件[10],维生素C的专属性不好,辅料HA和PVP K90对测定存在干扰。本实验利用冰醋酸调节流动相pH,结果表明,流动相为乙腈-水-冰醋酸(10 ∶89 ∶1),流速为0.6 ml/min时,维生素C峰形良好,保留时间适宜,且与辅料具有良好的分离度。

本文建立了利用高效液相色谱测定可溶微针中维生素C含量的方法,此方法简便快速,专属性、准确度及精密度良好。可作为含维生素C的可溶微针贴片质量控制方法,为美白可溶微针贴片的研究提供方法依据。