响应面法优化紫甘薯发酵酒的工艺条件

2019-05-31于聪李艳

食品研究与开发 2019年11期

于聪，李艳，2，*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄 050018）

紫甘薯属甘薯类植物，又名紫薯、山川紫[1-2]，我国广为种植[3]，因土壤差异和栽培条件不同，形态和成分也不同[4-7]。紫甘薯富含丰富的花青素类功能物质和膳食纤维，日益成为大众追捧的健康饮食，深加工产品开发日渐深入[8-10]。目前利用紫甘薯开发的深加工产品有速溶紫甘薯粉、红薯啤酒、红薯葡萄酒等[11]。

冀紫薯2号是河北省农林科学院粮油作物研究所选育的紫甘薯新品种，本研究以此为原料，通过单因素和Box-Behnken 响应面试验优化紫甘薯酒的发酵工艺条件，酿造紫甘薯发酵酒，为紫甘薯新品种的深加工奠定应用基础，扩大工业开发价值和市场潜能。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

紫甘薯-冀紫薯2号：河北省农林科学院粮油作物研究所；α-淀粉酶（883 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：上海宝曼生物科技有限公司；葡萄糖、没食子酸：天津市红岩化学试剂厂；氢氧化钠：天津市福晨化学试剂厂；石油醚：天津市津东天正精细化学试剂厂；酒石酸钾钠、柠檬酸：天津市永大化学试剂有限公司；苯酚：天津市标准科技有限公司，以上试剂均为分析纯。商用活性干酵母（安琪、SC、F15）：北京赛普瑞森技术有限公司。试验中用到的仪器与设备见表1。

表1 试验仪器设备表Table 1 Table of experimental equipments

1.2 试验方法

1.2.1 紫甘薯酒酿造工艺流程

新鲜紫甘薯清洗→剔除霉斑→蒸熟→加热水打浆→淀粉液化→调节pH 值，糖化→调节pH 值，接种酵母→发酵→陈酿→澄清处理→过滤→紫甘薯酒

1.2.2 紫甘薯酒酿造工艺说明

原料预处理：新鲜紫甘薯清洗后剔除霉斑，取样检测各种基础理化数据，包括：水分、淀粉、总糖、还原糖、滴定酸、粗脂肪、粗蛋白、花色苷和总酚等。

蒸熟、打浆：新鲜紫甘薯切片1 cm 厚，常压蒸煮40 min，出锅后添加预先加热到90℃以上热水，料液比 1∶5（g/mL），打浆搅拌均匀。

淀粉液化和糖化：紫甘薯淀粉的液化和糖化采用耐高温α-淀粉酶和糖化酶。淀粉酶加量2 U/g 原料，于92.5℃液化75 min；糖化酶加量400 U/g 原料，调pH 4.5，于50℃糖化50 min，制得紫甘薯糖液。

紫甘薯酒发酵：调整紫甘薯糖液的糖含量至220 g/L，pH 4.0，接种酵母菌进行控温发酵制得紫甘薯发酵原酒。

陈酿、澄清、过滤：主发酵结束后，经1个月左右后发酵，虹吸法倒罐去除酵母泥和沉淀物得到紫甘薯原酒。将原酒置于温度恒定在14℃～15℃的地下室陈酿半年，虹吸取上清液，加明胶澄清，经过滤后得到紫甘薯发酵酒。

1.2.3 紫甘薯酒发酵工艺单因素试验

酵母菌种选择：紫甘薯糖液调pH 4.0，分别接种安琪、SC 和 F15 酿酒酵母，接种量 2×106个/mL，控制28℃发酵，以CO2生成量和残糖含量为评价指标，选择发酵速度快的菌种。

再以选定的酵母菌进行发酵条件的单因素试验，以CO2生成量、糖含量和酒精度为评价指标。紫甘薯糖液调pH 4.0，分别固定发酵温度24℃，酵母接种量2×106个/mL，发酵时间10 d，分组试验的变量分别为：酵母接种量1×106、2×106、3×106、4×106、5×106（个/mL）；发酵温度：16、20、24、28、32℃；发酵时间 6、7、8、9、10、11 d。

1.2.4 响应面试验设计优化发酵条件

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 响应面设计法[12-15]优化紫甘薯酒发酵工艺条件，以酒精度为评价指标，选择酵母接种量、发酵温度、发酵时间3个因素，因素水平表见表2。

表2 紫甘薯发酵响应面试验因素水平表Table 2 Table of purple sweet potato fermentation response surface factor level

1.2.5 检测方法

水分：称重法，清洗好的紫甘薯称重后放入55℃烘箱烘干，恒重后再称重。

式中：A1为样品烘干前的总重量，g；A2为样品烘干后的净重量，g。

酒精度：比重计法[16]，取50mL 发酵后的酒样和50mL去离子水于蒸馏瓶中，取50 mL 蒸馏液，测定其酒精度。

CO2生成量：称重法。对应每个发酵罐，取250 mL三角瓶2只，装液量100 mL，安装呼吸阀，只有CO2逸出，接种酵母菌为发酵0 时，每天称重1 次～2 次，直到发酵结束，计算CO2生成量。

淀粉：GB/T 5009.9-2016《食品安全国家标准食品中淀粉的测定》中酸水解法[17]。

总糖：GB/T 15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》中苯酚硫酸法。

还原糖：GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的斐林试剂滴定法。

粗脂肪：索氏抽提法[18]。

粗蛋白：GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中第二法。

滴定酸：GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中 pH 计法[19-20]。

花色苷：pH 示差法[21-22]，吸取酒样 1 mL，分别加入12 mL pH 1.0 的缓冲溶液、12 mL pH 4.5 的缓冲溶液，避光放置15 min，在520 nm 和700 nm 波长处测定吸光度。根据以下公式计算花色苷总量。

式中：X 为总花色苷含量，mg/L；A 为（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；M 为 449.2 g/mol；ε 为摩尔消光系数/[L/（mol·cm）]，26 900。

色度和色调：分光光度计法[23]：检测样品420 nm（A1）、520 nm（A2）、620 nm（A3）时的吸光度。

1.2.6 紫甘薯酒感官评价

紫甘薯酒的感官测评参照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》。组织具有一定品酒技能和知识的8个人进行品尝，从色泽、香气、口感、组织形态4个方面进行描述评价。感官品评表见表3。

1.2.7 重复试验和数据处理

所有试验均为3 次以上重复。线性方程、重复性和准确性试验的数据均由Excel 2010 计算得出；采用Design-Expert 6.0.10 软件进行响应面试验设计，Origin 8.5 软件作图，Spss 17.0 统计分析软件进行数据处理，应用单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯法（Duncan's）差异分析。

表3 紫甘薯酒感官评价打分表Table 3 Purple sweet potato wine sensory evaluation score sheet

2 结果与分析

2.1 原料成分分析

冀紫薯2号紫甘薯是河北省农林科学院粮油作物研究所选育的紫甘薯新品种，相关理化指标检测数据见表4。

表4 冀紫薯2号理化指标检测数据表Table 4 Table of ji zi no.2 purple sweet potato's physical and chemical indicators test data

由表4数据分析，冀紫薯2号的淀粉含量占原料干物质的30.23%，淀粉经蒸煮，加水和加酶水解后得到糖，糖是发酵酒的物质基础，本研究经双酶法水解后的糖液含可发酵性糖42.6 g/L，为了酿造酒精度12%vol 以上的发酵型紫甘薯酒，在接种酵母菌前添加蔗糖，调整糖含量至220 g/L。紫甘薯花色苷和总酚分别占干物质的3.35%和11.03%，经发酵保留到酒中赋予紫甘薯酒抗氧化、降血糖、改善肝功能、防癌等保健功能[24]和鲜艳的色泽外观。粗脂肪和粗蛋白在水解和发酵过程中都会发生一定程度的水解，在陈酿和澄清时需予以去除。

2.2 紫甘薯酒发酵工艺条件单因素试验结果

2.2.1 酵母菌种的确定

各种酵母菌的发酵条件有一定差异，以CO2生成量和残糖检测值为评价指标，选择发酵时间短、降糖速率快，酒颜色好的酵母菌种进行紫甘薯酒的发酵，结果见图1。

图1 酵母菌种选择Fig.1 Selected yeast strains

由图1可见，在相同时间内，安琪酵母的CO2释放量比SC 和F15 酵母菌的多，降糖速率也快。CO2是酒精发酵的副产物，与酒精相伴而生。降糖速率快说明酵母菌的发酵和原料转化能力强，在28℃条件下安琪酵母2 d 已经将糖降至接近于零，比另外两株酵母菌达到相同情况快20 多个小时，虽然发酵时间太短或许会使酿造的酒口感粗糙，但可以通过适当降低发酵温度，延长发酵时间促成风味物质的生成。

2.2.2 酵母接种量对发酵的影响

以安琪酵母发酵紫甘薯酒，5个不同接种量的发酵试验结果如图2，方差分析见表5。

图2 酵母接种量对紫甘薯酒发酵的影响Fig.2 Effect of yeast inoculum on fermentation of purple sweet potato wine

表5 酵母接种量方差分析结果Table 5 Variance analysis of yeast inoculation amount

利用spss 软件，以5组接种量每组3个平行作为因子，酒精度作为评判指标进行了单因素ANOVA，分析结果如表5，P=0.000〈0.05（显著性水平在0.05）显著；多重比较检验的结果如图2A。由图2可知，酵母菌接种量为2×106个细胞/mL 时，酒精度最高，达到12.2 % vol，且CO2生成量最多，降糖速率也最快，24℃发酵10 d 时，残糖几乎为零。一般情况下，在发酵温度固定时，随着接种量加大，发酵速率也加快。但在液体糖含量一定时，接种量过大，酵母生长和生存所需物质增加，造成酒精生成量降低，所以最优酵母接种量取 2×106个/mL。

2.2.3 温度对发酵的影响

发酵温度影响酵母的生长速度和酒精生成，温度对紫甘薯酒发酵的影响见图3，方差分析见表6。

图3 温度对紫甘薯酒发酵的影响Fig.3 Effect of temperature on fermentation of purple sweet potato wine

表6 发酵温度方差分析结果Table 6 Results of variance analysis of fermentation temperature

利用spss 软件，以5组发酵温度每组3个平行作为因子，酒精度作为评判指标进行了单因素ANOVA，分析结果如表 6，P=0.000〈0.05（显著性水平在 0.05）显著；多重比较检验的结果如图3A。由图3可知，发酵温度低于24℃时，发酵液启酵慢，发酵时间长，酒度低；发酵温度高于28℃，酵母菌的降糖速率过快，发酵剧烈，酵母菌衰老也快，最终生成的酒度低。24℃发酵时，酒精产生量最大，发酵和降糖速率适宜，所以最优发酵温度为24℃。

2.2.4 发酵时间的影响

在确定的发酵温度和酵母接种量条件下，发酵时间对紫甘薯酒精度的影响如图4，方差分析见表7。

图4 发酵时间对紫甘薯酒酒度的影响Fig.4 Effect of time on fermentation of purple sweet potato wine

表7 发酵时间方差分析结果Table 7 Results of variance analysis of fermentation time

利用spss 软件，以6组发酵时间每组3个平行作为因子，酒精度作为评判指标进行了单因素ANOVA，分析结果如表 7，P=0.000〈0.05（显著性水平在 0.05）显著；多重比较的结果如图4。由图4可知，在酵母接种量固定2×106个细胞/mL，24℃发酵时，随着发酵时间延长，酒度提高，总糖降低，超过10 d 后，发酵液中可利用的糖耗尽，安琪酵母开始利用发酵产物-酒精为碳源来维持自身的生长和繁殖，从而使酒精度降低[25]。因此，选择发酵时间10 d 进行下一步的优化。

2.3 响应面试验优化发酵工艺条件

在单因素试验结果基础上，通过Design-Expert 6.0.10 软件设计Box-Behnken 响应面试验，以酒精度为评价指标，结果见表8。

表8 紫甘薯发酵响应面设计及结果Table 8 Design and results of response surface for fermentation purple sweet potato

续表8 紫甘薯发酵响应面设计及结果Continue table 8 Design and results of response surface for fermentation purple sweet potato

2.3.1 响应面回归分析

对表8 的试验结果，采用试验因素的相关性来解释，试验的误差越小越好，用方差分析评价结果的显著性，见表9。

表9 回归模型的方差分析Table 9 Analysis of variance of regression model

通过软件分析，得到接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）3个自变量对紫甘薯酒酒度的动态参数方程：

酒精度/（%/vol）=12.36+0.15A+0.16B-0.16C-0.55AB-0.37BC-1.12A2-1.02B2-0.75C2

回归模型的有效性指F 检验，包括失拟性检验和回归方程显著性检验[26]两部分。回归模型的系数反映显著性。表6 回归模型方差分析可见：模型显著性检验P=0.008 9〈0.05，说明该模型具有统计学意义。自变量二次项A2（P=0.002 5）、B2（P=0.004 0）、C2（P=0.018 2）均低于0.05 说明显著，二次项AB 不显著（P=0.064 4〉0.05）；所用模型与实验拟合的程度用失拟项说明，即二者差异的程度，因为失拟项P〈0.0001 表示极显著，没有失拟因素存在，所以对模型有利，因此，可用该回归方程对试验结果进行分析。该方程的决定系数R2=0.900 0，变异系数（C.V.）4.54，说明建立的模型能解释响应值变化的90.00%，模型的拟合程度较好，所以模型是合适的。

2.3.2 各因素交互作用的3D 响应面图和等高线图

响应面图形是响应值对各试验因素A、B、C所构成的三维空间立体曲面图，从响应面3D 图上可直观形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[27]。不同因素的响应面3D 图及相应等高线图见图5。

图5 两因素交互作用对紫甘薯酒酒精度高低的影响Fig.5 The influence of the interaction of two factors on the quality of purple sweet potato wine

由图5可较直观地看出各因素交互作用对紫甘薯酒酒度的影响：由接种量和温度交互作用的影响，紫甘薯酒酒精度先升高后下降（图5A）；因为接种量和时间交互作用的影响，紫甘薯酒酒精度先升高后下降（图5B）；又温度和时间交互作用的影响，紫甘薯酒酒精度先升高后下降（图5C）；响应值变化的大小[28]反应等高线的陡峭性，曲线越陡峭，则表明该因素对紫甘薯酒酒精度的影响越大。交互作用的强弱表现为等高线的形状，交互作用显著为椭圆，交互作用不显著为圆形[29]。接种量和温度交互作用的等高线比接种量和时间、温度和时间交互作用的等高线密集且陡峭，所以接种量和温度对安琪酵母发酵影响较大。

2.3.3 最佳试验条件预测与验证

根据Design-Expert 软件的分析结果，得到紫甘薯红酒理论预测最佳工艺条件为：接种量2.05×106个/mL，温度24.36℃，发酵时间9.74 d，最终达到的酒精度为12.38%vol 对最佳发酵条件进行验证试验，考虑到实际操作条件，将最佳工艺参数修正为：接种量2×106个/mL，温度24℃，发酵10 d，在该条件下进行3 次平行试验最终测得紫甘薯酒酒度为12.2%vol，与预测值接近，拟合试验误差1.5%，重复效果较好。