SHOX2基因与特发性心房颤动的关系研究

心房颤动(AF)是临床最常见的心律失常，可占心律失常住院患者的1/3。AF 可诱发认知功能障碍、脑卒中、心动过速性心肌病、心力衰竭及心源性猝死等[1]。尽管AF可继发于高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病和甲状腺功能亢进等疾病[1]，但有部分患者的AF病因不明，称之为特发性AF(IAF)，主要与遗传危险因素密切相关[2]。目前已经发现了30多个IAF相关基因，其中大部分基因编码心脏钾离子通道、钠离子通道、钙离子通道和缝隙连接通道[2]。近年来的研究发现，心脏转录因子基因突变也可导致IAF[3]。作为重要的心脏转录因子，SHOX2基因突变可导致家族性IAF[4]，但SHOX2基因突变是否可导致散发性IAF仍有待研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究自中国上海地区汉族人群中入选178例家族史阴性的散发性IAF患者，其中男性103例，女性75例，年龄为39～58岁，平均年龄(56.15±4.35)岁；入选218名种族、性别和年龄匹配的无AF家族史的健康对照者，其中男性127例，女性91例，年龄为40～59岁，平均年龄(56.31±4.20)岁。全部入选对象经过详细询问病史、全面体格检查、常规化验检查、超声心动图检查和标准12导联心电图检查。散发性IAF的诊断依据2014年发布的AF治疗指南[1]。本研究符合医学伦理规范。

1.2 方法

1.2.1 SHOX2基因的体外扩增 经知情同意后收集外周静脉血约2 mL，使用DNA分离试剂盒(德国Qiagen公司)纯化基因组DNA。体外特异性扩增SHOX2基因编码外显子、外显子两侧部分内含子及部分5′和3′端非翻译区所用的引物如参考文献[5]所述。以纯化的基因组DNA为模板，使用热启动Taq DNA聚合酶(英国NEB公司)和SHOX2基因特异性扩增引物等聚合酶链反应(PCR)试剂在PE9700型PCR仪(美国Applied Biosystems公司)上扩增SHOX2基因目的片段。PCR反应物的总体积为50 μL，包括10×PCR缓冲液5 μL，5×Q溶液10 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL、热启动 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，基因组DNA(100 ng/μL)2 μL和双蒸水26.5 μL。PCR的反应条件如参考文献[5]所述。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用凝胶回收试剂盒(中国Sangon公司)纯化。

1.2.2 SHOX2基因的PCR测序分析 以前述的纯化的PCR产物为模板，使用测序试剂盒(美国Applied Biosystems公司)和1条SHOX2基因特异性扩增引物在PE9700型PCR仪(美国Applied Biosystems公司)上进行测序反应。测序PCR混合物的总体积为10 μL，其中预混合液4 μL，上游引物(2 μmol/L) 1 μL，纯化的DNA片段(20 ng/μL)2 μL，双蒸水3 μL。测序PCR的条件设置如参考文献[5]所述。测序PCR产物经过纯化后在3130 XL型DNA测序仪(美国Applied Biosystem公司)上进行测序。将所测的SHOX2序列与Nucleotide数据库中的SHOX2序列(登陆号：NM_003030)进行对比分析以发现SHOX2基因变异。如发现SHOX2基因变异，则检索人类基因组突变数据库(HGMD)、单核苷酸多态性数据库(SNP)、外显子组整合数据库(ExAC)、生物医学文献数据库(PubMed)和万方数据库以评估所发现的基因变异是否有过报道。

1.2.3 突变氨基酸的进化保守性分析 借助在线程序MUSCLE(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene?cmd=Retrieve&dopt=MultipleAlignment&list_uids=68535)评估突变氨基酸在多物种进化上是否保守。

1.2.4 SHOX2基因变异的致病性分析 使用在线软件PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)和PROVEAN(http://provean.jcvi.org)预测分析所发现的SHOX2基因变异是否具有致病性。

2 结果

2.1 发现新的SHOX2基因突变

通过测序分析178例散发性IAF患者的SHOX2基因，在1例42岁的男性IAF患者中发现了1个新的杂合突变，其SHOX2基因编码核苷酸序列第632位的鸟嘌呤(G) 变为胞嘧啶(C)，即c.632G>C突变，相当于SHOX2蛋白之氨基酸序列第211位的色氨酸(Trp)变为丝氨酸(Ser)，即p.Trp211Ser突变。经过查询中外各数据库，均无SHOX2基因c.632G>C变异报道，表明本研究所发现的SHOX2基因突变是1个新突变。SHOX2基因c.632G>C杂合突变及其纯合野生型序列见图1。

2.2 突变氨基酸在物种进化上完全保守

人、大猩猩、猴、狗、牛、小鼠、大鼠、禽、斑马鱼和蟾蜍等多物种SHOX2蛋白之氨基酸序列比对分析表明，第211位的色氨酸在多物种进化上完全保守(见图2)。

注：箭头所指分别为SHOX2基因c.632G>C杂合突变型G/C和纯合野生型G/G序列

注：箭头所指为SHOX2蛋白之氨基酸序列第211位的色氨酸

2.3 SHOX2基因c.632G>C为致病性突变

SHOX2基因变异c.632G>C被在线计算机软件PolyPhen-2预测为致病性突变，预测值为1.00(敏感性为0.00、特异性为1.00)；被MutationTaster预测为致病性突变，预测值为1.00；被PROVEAN预测为致病性突变，预测值为-13.11。此外，在MutationTaster数据库没有SHOX2基因c.632G>C变异，进一步提示该SHOX2基因c.632G>C变异是1个新突变。

3 讨论

本研究在1例散发性IAF患者中发现了新的SHOX2基因杂合性突变c.632G>C(p.Trp211Ser)，但该基因杂合突变不存在于218名健康对照者。该突变氨基酸在人、大猩猩、猴、狗、牛、小鼠、大鼠、禽、斑马鱼和蟾蜍等多物种进化上完全保守，而且在线计算机软件PolyPhen-2、MutationTaster和PROVEAN的预测分析结果均表明该突变是致病性突变。因此，SHOX2基因c.632G>C(p.Trp211Ser)突变极有可能是该IAF患者的分子病因，但该基因突变的致AF机制仍有待于进一步研究。

SHOX2基因定位于人染色体3q25.32，主要编码一种由355个氨基酸残基组成的转录因子蛋白[4]。既往的研究发现，SHOX2在心脏转录调节多个重要基因的表达，包括TBX5、HCN4、NKX2-5、CX40、CX43和NPPA等[4,6]，而且TBX5、HCN4、NKX2-5、CX40、CX43和NPPA基因突变均可导致AF[7-13]。因此，SHOX2基因突变可能通过影响TBX5、HCN4、NKX2-5、CX40、CX43和NPPA等心脏关键基因的表达而导致AF。

SHOX2基因缺陷增加AF的易感性可部分归因于心脏尤其是窦房结发育不良。在动物和人胎心发育期间，SHOX2大量表达于心脏的静脉窦区域，包括窦房结和静脉窦瓣膜[4]。小鼠SHOX2基因敲除可致其胚胎期死亡，主要原因在于窦房结发育不良和严重的窦性心动过缓，同时伴有窦房结特异性标志基因HCN4和TBX3表达下调及窦房结区域NKX2-5、CX40、CX43和NPPA的异位表达[14-15]。斑马鱼SHOX2基因沉默可因胚胎心跳过于缓慢而导致心包积液、充血，而心肌特异性表达SHOX2可以恢复其正常心率[16]。动物和临床研究均表明窦房结功能不良是AF的重要诱发因素[17]。这些研究结果表明SHOX2在心脏胚胎尤其是窦房结发育及AF发生方面具有重要作用。

值得一提的是，SHOX2基因变异与人类AF的关系已有报道。Hoffmann等[18]对378例早发AF患者的SHOX2基因进行了测序分析，在其中2例患者中各发现了1种杂合错义突变(p.Gly81Glu和p.His283Gln)。功能研究发现p.Gly81Glu突变型SHOX2对靶基因ISL1和BMP4的转录激活功能无影响，而p.His283Gln突变型SHOX2对靶基因ISL1和BMP4的转录激活功能丧失[18]。斑马鱼实验发现p.His283Gln突变严重抑制心脏的起搏功能18]。Li等[4]对162例家族性AF患者的SHOX2基因进行了测序分析，在其中1例患者中发现了1种杂合无义突变(p.Arg194X)。功能分析表明p.Arg194X突变型SHOX2对靶基因ISL1和BMP4的转录激活功能丧失。这些观察结果连同本研究结果提示SHOX2基因突变可能是部分AF的分子病因。

本研究揭示了散发性IAF相关SHOX2基因新突变，扩大了AF相关SHOX2基因突变谱，对AF患者的遗传咨询和早期防治具有潜在的临床意义。