靶向活化转录因子6的短发夹RNA重组腺病毒载体构建及对猪瓣膜间质细胞增殖与凋亡的影响

主动脉瓣膜钙化是一种退行性病变，是发达国家最常见的瓣膜疾病。随着我国人口老龄化加快，退行性瓣膜病呈增加趋势[1]，但发病机制尚未明确。瓣膜间质细胞(VIC)是主动脉瓣膜中的主要细胞，对维持瓣膜正常生理功能起重要作用。有研究发现在高脂血症动物和ApoE-/-鼠模型的钙化主动脉瓣中存在内质网应激(ERS)[2]，可能通过促进VIC凋亡引起主动脉瓣膜钙化[3]。活化转录因子6(ATF6)作为ERS信号通路之一，是否可引起VIC凋亡、在主动脉瓣钙化中发挥作用未见报道。本研究构建了靶向ATF6的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒载体，探索ATF6对VIC增殖与凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、细胞和细菌 穿梭质粒pAd-U6-MCS-CMV-GFP-Δloxp、骨架质粒pAd-BHG、HEK293细胞、VIC以及大肠杆菌菌株DH5α，保存于本实验室。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamHI和EcoRI、T4DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific公司，质粒DNA抽提试剂盒购自北京康为公司，DNA凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物公司，Lipofiter转染试剂购于汉恒生物公司，引物由上海生工公司合成。胎牛血清、胰酶购于Hyclone公司，ATF6抗体、胱天蛋白酶(caspase)-3抗体购于Abcom公司， FLAG抗体购于CST公司，β-actin、GAPDH单克隆抗体购于SantaCruz公司，HRP标记的抗兔、抗鼠IgG二抗购于Bioworld公司。SDS凝胶配置试剂盒、电化学发光试剂购于Beyiotime公司。由华大基因公司提供测序服务。

1.2 方法

1.2.1 ATF6-shRNA腺病毒穿梭质粒构建 从美国国家生物技术信息中心GenBank中查询猪ATF6基因序列，设计合成小干扰RNA(siRNA)序列。siRNA1:5′-GCCAGGCGAATGAATCCTAGTGTGAA-3′; siRNA2:5′-GCATGAAGTGGAAAGGACCAAGTCAA-3′; siRNA3: 5′-GAGAATGTGATCAACGGGCAGGATTA-3′。合成双链oligo片段见表1。稀释oligo片段至100 μmol/L，退火：95 ℃、75 ℃、55 ℃、35 ℃、15 ℃依次各10 min。使用限制性内切酶BamHI和EcoRI对表达载体pAd-U6-MCS-CMV-GFP-Δloxp进行酶切使载体线性化，对酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切效果，并回收凝胶酶切片段。使用T4DNA连接酶将双链DNA连接到线性化的表达载体，转入感受态细胞DH5α，37 ℃恒温培养箱过夜。平板挑菌，进行PCR鉴定，上游引物： 5′-AATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′；下游引物： 5′-TCGTTGGGCGGTCAGC-3′，将鉴定得到的阳性克隆菌液送测序验证。

表1 DNA oligo片段

1.2.2 Western blot检测干扰质粒效率 设立ATF6-shRNA1-1、ATF6-shRNA2-1、ATF6-shRNA3-1、Ad-GFP组，将HEK293细胞接种于6孔板，当细胞融合度达70%时，更换新鲜培养基。将3组干扰质粒、Ad-GFP与过表达腺病毒载体共转染，在转染48 h后提取总蛋白。过表达腺病毒载体含有Flag基因，通过Western blot检测Flag蛋白降低水平。经检测选择ATF6-shRNA2进行下一步实验，按照说明书进行质粒抽提。

1.2.3 ATF6-shRNA腺病毒包装扩增及滴度鉴定 将HEK293细胞接种至直径6 cm培养皿，当细胞融合度达70%时，提前1 h更换新鲜培养基。将重组干扰质粒2 μg与骨架质粒pAd-BHG 4 μg混匀后再与15 μL Lipofiter试剂混合，复合物加入培养基中，6 h后更换新鲜培养基。11 d后观察到大部分HEK293细胞发生细胞病变，将所有液体收集于15 mL离心管中，在液氮和37 ℃水浴中反复冻融3次，1500 转/min离心5 min，收集上清，继续转染HEK293细胞，按照上述方法扩增得到第3代病毒，命名为Ad-ATF6-shRNA2。通过改进的TCID50法检测病毒滴度为1.26×1010噬菌斑形成单位/mL(PFU/mL)。

1.2.4 PCR检测ATF6-shRNA腺病毒转染效率 设立阴性对照组(NC组)、Ad-ATF6-shRNA2组、Ad-GFP组，通过Trizol法从转染病毒后的细胞中抽提总RNA，配制逆转录体系，逆转录条件为：37 ℃，20 min；85 ℃ 30 s。上游引物: 5′-TGGGGCCACTCTTACTTCTG-3′；下游引物： 5′-AATCACTCCACGGACACTGT-3′。采用两步法进行荧光定量PCR反应，每个样本设置3个重复，以平均Ct值作为样本Ct值。

1.2.5 VIC内源ATF6蛋白检测 3代VIC融合度达70%时转染病毒，感染复数(MOI)为1，转染6～8 h后更换新鲜培养基，转染72 h收集细胞提取总蛋白，Western blot检测细胞内ATF6蛋白表达，配制显影液，于暗室中将显影液涂于PVDF膜上，曝光1 s。

1.2.6 VIC内源caspase-3蛋白检测 在明确Ad-ATF6-shRNA2转染VIC后可显著降低ATF6表达之后，Western blot检测细胞内caspase-3蛋白表达，方法同上。

1.2.7 细胞增殖活性检测 将3代VIC制备成细胞悬液，加入96孔板中，每孔细胞数大约2×104个，设置1 d至7 d组，转染病毒分别培养1、2、3、4、5、6、7 d后加入10 μL CCK-8试剂，恒温培养箱中培养1 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.3 统计学分析

所有连续变量以均数±标准差表示，两组组间比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验。统计学处理采用 SPSS 19.0 软件处理。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测Flag蛋白表达水平降低

在4组中，ATF6-shRNA2降低Flag表达水平的效果最好，约下调60%，见图1。因此选择ATF6-shRNA2进行下一步实验。

注：1～3为ATF6 shRNA1-1、2-1、3-1和ATF6过表达腺病毒载体共转染HEK293细胞；4为Ad-GFP和AFT6过表达腺病毒载体共转染HEK293细胞

图1 Western blot检测HEK293细胞中Flag表达

2.2 转染重组腺病毒后VIC中ATF6表达降低

实时定量PCR检测ATF6表达变化，Ad-ATF6-shRNA2组(0.76±0.66)ATF6的表达较Ad-GFP组(0.97±0.55)和NC组(设为1)显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot进一步验证Ad-ATF6-shRNA2组ATF6表达水平明显降低，表明靶向ATF6的shRNA腺病毒构建成功。

2.3 沉默ATF6表达后caspase-3表达降低

与NC组和Ad-GFP组相比，Ad-ATF6-shRNA2组caspase-3表达明显降低，表明沉默ATF6表达减轻VIC凋亡，见图2。

图2 Western blot检测VIC中caspase-3表达

2.4 沉默ATF6表达后促进细胞增殖

与Ad-GFP组相比，Ad-ATF6-shRNA2组的吸光度自第2天起至第7天显著升高(P<0.05)，表明沉默ATF6后VIC活性自第2天起升高，见表2。

表2 Ad-GTF6和Ad-ATF-shRNA2组的吸光度值/OA(450 nm)

3 讨论

目前，对主动脉瓣膜钙化尚无有效预防手段，只有因瓣膜严重钙化、出现血流动力学紊乱时才手术干预。内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要膜性细胞器，当受到刺激时，内质网的蛋白折叠功能发生紊乱，出现ERS，启动未折叠蛋白反应(UPR),UPR包含3条信号通路，ATF6是其中之一。轻中度UPR有促存活作用，但是持续严重的UPR会引发促凋亡信号。当VIC凋亡时，钙盐被动沉积在主动脉瓣膜，在主动脉瓣膜钙化中起部分作用[4]。关于ATF6引发凋亡造成瓣膜或者骨组织钙盐沉积的研究尚未见文献报道。

细胞凋亡是一种有序的消除潜在有害细胞和维持细胞稳态的重要机制，caspase-3作为凋亡途径中的关键执行酶，其水平可以反映细胞凋亡的情况。本研究发现，沉默VIC中ATF6的表达后caspase-3表达降低，而VIC活性自第2天起升高，提示ATF6在VIC凋亡过程中可能发挥作用，抑制ATF6表达可促进VIC存活。在血管内皮细胞的研究中，抑制ATF6表达可降低凋亡相关基因的表达，包括caspase-3/9等[5]；在小鼠卵巢颗粒细胞的研究中，转染靶向ATF6的shRNA重组腺病毒后，通过流式细胞术和TUNEL检测，发现细胞凋亡减少[6]，与本研究结果一致。ATF6可能通过caspase-3途径介导凋亡，ATF6下游凋亡信号通路可能还涉及如CCAAT增强子结合蛋白(CHOP)/生长阻滞和DNA损伤诱导基因153(GADD153)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)以及caspase家族[7-8]等，具体机制还需进一步研究。

本研究通过RNAi方法构建了沉默猪ATF6基因表达的重组腺病毒载体。RNAi是通过细胞内源性和外源性双链RNA互相作用，在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活[9]，其包括siRNA和shRNA机制。shRNA介导的RNAi能够使用病毒载体进行转染，可以减少脱靶。本研究使用腺病毒作病毒载体,该病毒操作容易，安全性较高；宿主范围广,可以感染多种细胞；基因组信息明确。使用Admax包装系统，在HEK293细胞中，利用Cre/loxP(或FLP/frt)重组酶将携带外源基因的穿梭质粒与骨架质粒连接重组,进而产生重组腺病毒[10]。

综上所述,本研究成功构建了ATF6的shRNA质粒，包装得到shRNA2-ATF6重组腺病毒，重组腺病毒可以成功高效干扰VIC中ATF6的表达，有效减少VIC凋亡，并促进细胞增殖，为后续细胞及动物实验打下基础。