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TRPV1和相关细胞因子对儿童哮喘调控机制研究

2019-05-29游海星林鲁飞

重庆医学 2019年5期
关键词:细胞因子位点支气管

游海星,林 坚,林鲁飞

(海南省海口市第三人民医院儿科 570102)

支气管哮喘是一种常见的儿童呼吸道疾病。据WHO统计,近年来美国、澳大利亚及欧洲发达国家儿童哮喘的发病率和病死率均有所上升。在中国,儿童哮喘患病率也呈现上升的趋势[1]。哮喘严重影响儿童的身心健康,已经成为世界范围内的一个重要的公共卫生问题[2]。香草醛亚型1(TRPV1)受体是由辣椒素激活的辣椒素受体,它为阳离子通道超家族成员并广泛表达于哺乳动物呼吸系统[3]。研究表明TRPV1在儿童支气管哮喘发病调控中有重要影响[4]。随着对呼吸系统炎症机制的深入了解,哮喘中TRPV1基因信号调节已成为一个研究热点。众所周知,支气管哮喘是一种由多种细胞和细胞因子共同参与的慢性呼吸道炎症性疾病[5]。然而,目前TRPV1及相关细胞因子信号转导通路,在儿童支气管哮喘的发病机制中尚不清楚。本研究拟通过临床数据,KEGG数据库及回顾性分析筛选儿童支气管哮喘相关的细胞因子,建立儿童支气管哮喘TRPV1及相关细胞因子调控网络,为研究儿童支气管哮喘的发病机制提供一定的线索。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2016年12月在本院儿科就诊的3~14岁哮喘患儿100例作为病例组,其中男57例,女43例,体质量(18.2±5.4)kg。选择同期来本院做健康体检的儿童100例作为对照组,其中男59例,女41例,体质量(17.7±4.8)kg。病例组患儿的哮喘诊断均符合国际哮喘指南。对照组儿童无哮喘家族史、个人过敏史及支气管哮喘病史。所有研究对象的监护人均签订知情同意书,本研究获得海口市第三人民医院伦理委员会审批通过。

1.2方法

1.2.1血液标本采集 接受哮喘治疗前,采集两组儿童的5 mL外周静脉血,吸取1 mL标本与乙二胺四乙酸(EDTA)混合抗凝用于提取总RNA,其余血液标本以2 000 r/min离心10 min后放于-70 ℃冰箱用于检测。

1.2.2受试者TRPV1 mRNA水平实时定量PCR检测 将1 mL外周静脉血与EDTA混合抗凝,用总RNA快速提取试剂盒从外周血淋巴细胞中提取RNA 。根据试剂盒操作手册使用Oligo DT作为引物,总RNA作为模板,利用反转录酶进行反转录合成cDNA。根据GenBank所列的TRPV1基因序列,合成TRPV1 mRNA上游引物序列和下游引物序列。上游引物序列:5′-GGC TGT CTT CAT CAT CCT GCT GCT-3′;下游引物序列:5′-GTT CTT GCT CTC CTG TGC GAT CTT GT-3′;PCR产物的大小是117 bp 。以GAPDH作为内参,实时定量PCR合成的GAPDH上游引物序列和下游组成引物序列为:上游引物序列:5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′,下游引物序列:5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′GAPDH PCR产物大小为87 bp。反应循环参数为:预变性94 ℃ 10 min;变性94 ℃ 30 s;退火56 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 30 s,总共40个循环,30个循环后延伸温度改为7 min,由Wilcoxon秩和检验计算置信区间和相对定量,用2-ΔΔCT比较病例组和对照组的TRPV1的相对表达水平。

表1 两组rs4790521和rs4790522基因型分布差异(n)

1.2.3筛选和检测目标SNP位点 参考美国国家生物技术信息中心NCBI SNP数据库,设定MAF(minor allele frequency)> 5%且r2>0.8,筛选出UTR-3基因的特定SNP。SNP检测:上海英骏生物技术有限公司测序PCR反应产物。

1.2.4血涂片细胞计数和全血清IgE检测 在400倍镜下进行嗜酸性粒细胞的计数,总血清IgE水平则通过双抗夹心的ELISA检测。

1.2.5细胞因子检测 ELISA检测病例组患儿治疗前后及对照组儿童血清中γ-干扰素(IFN-γ),IL-2,IL-17A,IL-4 和IL-5的水平,所有的检测步骤均按试剂说明书进行。

2 结 果

2.1两组TRPV1基因表达水平和SNP位点分析 病例组患儿外周血中的TRPV1基因表达水平为6.27±2.13高于健康儿童的3.08±1.25(t=12.92,P<0.01)。根据基因测序,两组间两个SNP位点(rs4790521和rs4790522)基因型分布也不同。根据基因测序结果rs4790521位点的分布,病例组与对照组的CC、CT、TT 3个基因型比较差异有统计学意义(P<0.05);等位基因C在病例组中远多于对照组(P<0.05)。而rs4790522位点的CC、CA、AA 3个基因型分布在两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),等位基因C在病例组中远多于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2儿童支气管哮喘的相关细胞因子水平和嗜酸性粒细胞计数 病例组患儿血清中IgE水平,嗜酸性粒细胞(EOS)计数,IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4和IL-5水平与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 两组哮喘的相关细胞因子水平和嗜酸性粒细胞计数比较

2.3儿童支气管哮喘相关的细胞因子和TRPV1基因Logistic回归分析 通过Logistic回归分析结果显示:外周血嗜酸性粒细胞计数、TRPV1 mRNA表达水平、IL-4和IL-5水平是儿童支气管哮喘的危险因素。见表3。

表3 儿童哮喘相关细胞因子和TRPV1基因的Logistic回归分析

2.4建立TRPV1基因的儿童支气管哮喘调控网络 根据KEGG信号通路数据库,对TRPV1和儿童支气管哮喘相关的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17A进行了分析,绘制出一个初步的儿童支气管哮喘的调控网络,见图1。儿童支气管哮喘调控网络非常复杂,且TRPV1与TH1、Th2和Th17等细胞因子均能引发儿童支气管哮喘。Th1可能提升肿瘤坏死因子(TNF)-β,IFN-γ和IL-2水平,Th2可能提升IL-4、IL-5和IL-10水平,Th17可能提升IL-17A水平,而IL-17A会影响IL-1β从而影响TRPV1。此外,某些可能导致免疫功能紊乱或外周敏感性增加、气管黏膜损伤的因素都会影响TRPV1水平,最后导致儿童支气管哮喘。

2.5突变位点rs4790522和rs4790521的具体定位 突变位点rs4790522和rs4790521均定位于TRPV1基因的3′非翻译区,见图2。

图1 儿童支气管哮喘部分调控网络

两条竖红线间的基因序列为TRPV1基因的CDS区基因序列;蓝色盒子中的为突变碱基;点线区的基因序列正是突变后消失的miRNA结合位点;直线区基因序列则为突变后新的miRNA结合位点

图2 突变位点rs4790522和rs4790521的具体定位

3 讨 论

近年来,TRPV1与儿童支气管哮喘的关系已成为哮喘病理机制研究的热点,且取得了一定的进展。如BAKER等[4]研究表明TRPV1可能是诱导儿童哮喘的重要信号调节因子。此外,TRPV1在支气管狭窄、蛋白分泌、气管黏膜水肿、炎性细胞趋化、咳嗽反射等方面也起着重要作用[6]。最近的研究表明TRPV1存在于免疫组化的T细胞中,且能调节CD4+T细胞活性及炎症细胞的特异性[7]。MCGARVEY等[8]在人气道上皮细胞发现功能性的TRPV1在难治性支气管哮喘患者气道中高表达。本研究对TRPV1基因测序发现病例组和对照组两个SNP位点基因型分布存在明显差异。TRPV1的mRNA水平和两个SNP位点可能是儿童哮喘发病的反映指标。

哮喘的另一个重要的致病机制与 Th1、Th2、Th17、Treg细胞因子不平衡有关。Th1型细胞因子主要参与细胞免疫。Th2型细胞因子主要引起一些病理反应,如增加血浆IgE水平,升高气道EOS,引起气道平滑肌的增生和肥大等。细胞因子Th17在促炎症反应和自身免疫中起重要作用。Treg型细胞因子可以通过分泌IL-10或细胞接触机制(CTLA-4和GITR)调节和抑制免疫反应。本研究显示两组外周血IgE水平、嗜酸性粒细胞计数均存在差异,这也表明了IgE水平和嗜酸性粒细胞计数在儿童支气管哮喘中起重要作用。此外,两组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17A水平也差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示嗜酸性粒细胞计数、IL-1、IL-5和TRPV1 mRNA水平是儿童支气管哮喘的危险因素。

本研究中建立调控网络包含的基因和细胞因子是通过搜索KEGG数据库结合其他的文献所构建的。儿童支气管哮喘调控机制十分复杂,且其中TRPV1、Th1、Th2、Th17之间又相互影响共同导致免疫功能紊乱或外周敏感增加引起儿童支气管哮喘。本研究建立的调控网络仅为儿童支气管哮喘调控机制的一部分。 国内外关于miRNA和儿童支气管哮喘的研究大多数集中于miRNA在支气管哮喘信号通路或者miRNA作为哮喘诊断标志等方面。HUO等[9]发现上皮细胞和血浆的miR-181b-15p是呼吸道嗜酸性增多的标志物,且能通过靶向调节促炎因子的表达产生嗜酸细胞性气道炎症。MAES等[10]的研究发现miR-223-3p、miR-142-3p及miR-629-3p在严重哮喘患者痰液中高表达。本研究显示TRPV1miRNA能作为气道炎症标志物。另外,rs4790522和rs4790521两个位点的突变在TRPV1的3′UTR端,3′调控区在基因表达方面起重要作用,在这个区域突变可能影响基因的表达。TRPV1基因rs4790521和rs4790522突变位点介导相应miRNA的改变可能是病例组和对照组间存在显著差异的潜在分子机制。本研究建立的儿童支气管哮喘调控网络,为儿童支气管哮喘机制研究提供了一定的理论基础。

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