结核感染血清学诊断技术的应用评价

翁绳凤,邢俊蓬,郭 威

(1.北京老年医院 检验科;2.北京老年医院 感染疾病科,北京100095)

结核病疫情严峻,但由于其临床症状和体征不典型,诊断和鉴别诊断较困难,导致漏诊和误诊率较高,因此迫切需要快速简便准确的实验室诊断方法,指导临床早期诊断。近年来,基于γ-干扰素体外释放试验建立起来的免疫学检测手段,在诊断结核分枝杆菌感染方面显示出良好的敏感性和特异性[1]。血清学(抗原、抗体、蛋白芯片)检测依然是结核病辅助诊断的重要手段之一[2],主要是操作简便,快速实用。这些手段对结核病诊断价值备受学者的广泛关注,为进一步了解结核感染T细胞斑点试验和结核抗体试剂盒在诊断结核病的应用价值,本研究通过回顾性分析,对结果进行比较,评价结核抗体检测和T-spot.TB试验在结核病诊断中的意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象及诊断标准

1.1.1研究对象 回顾性分析2015.11-2016.11期间疑似结核的住院患者临床资料(544例)。其中菌阳肺结核患者210例(均通过细菌学诊断确诊),平均年龄(62.93±20.37)岁；菌阴肺结核患者268例(均通过临床进行诊断),平均年龄(64.80±20.30)岁；非结核菌病患者66例,平均年龄(69.98±17.89)岁。三组患者同时进行过T-spot.TB,TB-DOT和ASSURE TB结核抗体检测。

1.1.2诊断标准 (1)菌阳肺结核诊断参照原卫生部《WS288-2008肺结核诊断标准》[3]执行。(2)菌阴肺结核：以中华医学会结核病学分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》[4]为依据，3次痰涂片及一次痰培养均为阴性的肺结核,具体诊断标准是1)典型的肺结核临床症状和胸部x线表现；2)抗结核药物治疗有效；3)临床可排除其他非结核性肺部疾病；4)PPD(5IU)皮肤试验强阳性,血清抗结核抗体阳性；5)痰结核分枝杆菌PCR探针检测阳性；6)肺外组织病理证实为结核病变；7)支气管肺泡灌洗液(BALF)检出抗酸分枝杆菌；8)支气管或肺部组织病理证实结核病变。具备1-6条中的三项或7-8条中任何一项可确诊。(3)非结核病患者,排除结核病诊断的呼吸系统疾病患者,包括肺炎,支气管扩张,慢性支气管炎,慢性阻塞性肺部疾病及肺恶性肿瘤,诊断参照《实用内科学》[5]执行。

1.2 试验及方法

1.2.1T-spot.TB试验 试剂盒是由英国Oxord Immunotec 公司生产。

①标本要求 采集外周全血4 ml,无需空腹,需用肝素/肝素钠抗凝,不能使用EDTA抗凝管；样本要求新鲜(在8 h内完成实验)；室温保存与运输；不能冷冻或冷藏；避免震荡引起溶血影响结果。

②外周血T淋巴细胞分离 抽取外周静脉血4 ml至肝素钠抗凝的无菌管,混匀,避免血液分层。缓缓加入到等体积的淋巴分离液的无菌离心管中,离心1 600×g 30 min,可见外周血单个核细胞(PBMC)存在于云雾层中,吸取淋巴细胞层,用1640培养液洗涤离心2次。显微镜下计数细胞数,用细胞培养液调至细胞数2.5×106/ml。

③结果判读标准 依据试剂盒说明书,如果阴性对照孔斑点形成细胞数(SFC)<6,检测孔SFC减去阴性对照孔SFC≥6,可判读为阳性,<6判读为阴性。如果阴性对照孔斑点形成细胞数(SFC)≥6,检测孔SFC为阴性对照孔2倍时,可判读为阳性。

1.2.2结核分枝杆菌抗体检测

①TB-DOT检测 试剂盒由上海奥普生物医药有限公司生产,可定性检测人血清中结核分枝杆菌抗体,用于临床结核病辅助诊断。

本试剂盒利用斑点免疫胶体金渗滤技术,将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化,点样并固化在硝酸纤维膜上,膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体,被捕获的结核IgG抗体可用葡萄球菌A蛋白(SPA)胶体金缀合物标记呈色(SPA能与IgG特异性结合),形成红色斑点,根据是否出现红色斑点即可判断阴阳结果,从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。

②ASSURE TB检测 试剂盒由新加坡MP生物医学亚太私人有限公司生产ASSURE TB(胶体金法),用于定性检测人血清、血浆或全血中的结核分枝杆菌IgG抗体。

本试剂盒(MP Diagnostice (MPD)ASSURE TB Rapid Test)应用间接固相免疫层析技术,当检测样本从样本孔向上迁移时,固定在膜上的结核抗原会与试验样本(血清、血浆或全血)中的特异性抗体形成抗原-抗体复合物。这种复合物与标记有相应二抗的胶体金结合,形成肉眼可见的紫红色条带,质控线上的蛋白A也同时与金标二抗结合作为样本正确加入的标记。如果在检测线处(T)和质控线处(C)出现紫色条带,则结核分枝杆菌抗体为阳性。任何深度的条带均应判作阳性。

1.3 统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,应用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况544例患者中,男253例,女291例。菌阳组210例,年龄19-93(岁),平均年龄(62.93±20.37)岁；菌阴组268例,年龄18-94(岁),平均年龄(64.80±20.30)岁；对照组66例,年龄21-94(岁),平均年龄(69.98±17.89)岁。三组在性别和年龄上差别无统计学意义,P>0.05。

2.2 检测结果三组患者采用T-spot TB和两种结核抗体金标试剂进行检测,结果见表1。菌阳肺结核患者 210例,其中Tspot-TB检测阳性率为84.28%(177/210),TB-DOT为64.28%(135/210),ASSURE TB为62.85%(132/210)。菌阴肺结核患者268例,其中Tspot-TB检测阳性率为76.87%(206/268),TB-DOT为44.77%(120/268),ASSURE TB为39.55%(106/268)。Tspot-TB检测方法的阳性率与两种抗体检测方法差异有统计学意义,P均为0.000,见表2。两种结核抗体检测方法的阳性率之间差异无统计学意义(χ2=1.210,P=0.3)。对照组66例患者中,检测特异性分别为Tspot-TB 78.79%(52/66),TB-DOT 77.27%(51/66),ASSURE TB 75.76%(50/66),三种方法特异性差异无统计学意义(χ2=0.173,P=0.917)。

表1 不同组别患者采用T-spot TB和两种结核抗体金标试剂的检测结果

表2 T-spot TB试剂盒与两种结核抗体试剂盒检测结核病组与对照组患者的诊断价值

注：表中的χ2值、P值分别为两种结核抗体检测灵敏度与T-spot TB灵敏度的比较结果

3 讨论

全球20亿人口感染结核[6],现有活动性结核患者2000万,新增活动性结核患者约900万/年,每年200-300万患者死亡。我国是22个结核病高负担国家之一,结核病早期诊断,早期规范治疗尤为重要。由ELISPOT发展而来的T-spot TB试验是用于检测特异性T细胞分泌的γ-干扰素,并据此判断是否感染结核分枝杆菌。刘红等[7]对1084例疑似肺结核患者进行研究,T-spot TB综合敏感度为86.2%,特异度为91.1%；万荣等[8]研究中显示168例结核病患者T-spot TB综合敏感度为86.9%；T-spot TB对免疫功能正常的成年人活动性结核病诊断的敏感度为83%-97%,综合敏感度90%[9,10]。本研究478例结核病患者T-spot TB诊断的综合敏感度为80.13%,略低于上述报道,可能是因为病例大多是老年人,老年肺结核患者机体免疫功能相对低下且多有合并症,可能影响T-spot TB敏感度[8]。T-spot TB在非结核病组中的阴性率为78.79%,低于国内外其他研究[7-10],可能与患者年龄及例数多少有关。

T-spot TB对菌阳肺结核和菌阴肺结核患者的检测敏感度分别为84.28%和76.27%,差异无统计学意义,P>0.05。结核抗体试剂盒TB-DOT对菌阳肺结核和菌阴肺结核患者的检测敏感度分别为64.28%和44.77%；ASSURE TB分别为62.85%和39.55%,差异有统计学意义,P<0.05,有利于结核病疗效的监测。这与刘毅[11]等报道的38 kDa蛋白血清抗体检测在诊断活动性肺结核上有较好的诊断和应用价值的结果一致。TB-DOT检测主要针对外膜抗原,ASSURE TB检测主要针对38 kDa抗原(相对分子质量为38000的抗原,简称为“38 kDa抗原”),而T-spot TB试验是针对早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP10)。

T-SPOT.TB与两种抗体检测方法在诊断结核病敏感性的差异有统计学意义(P<0.05),尤其对菌阴患者有显著差异(76.87% vs 44.77%和39.55%)。T-spot TB试验在结核感染的检出方面具有较高的灵敏度,但不能鉴别结核感染是活动性,陈旧性或潜伏性,因此在临床上T-spot TB阴性排除结核病意义较大,本次研究中三个试验的特异性分别为78.79%(T-SPOT.TB),77.27%(TB-DOT)和75.76%(ASSURE TB),差异无统计学意义。T-spot TB阳性时应根据患者临床症状,胸片及其他实验室检查,如抗酸杆菌涂片、结核抗体、PPD、ESR等综合考虑,最终判断患者是否为活动性肺结核。

综上所述,T-SPOT.TB试验在结核感染诊断中显示较高的敏感度和特异度,尤其在诊断菌阴肺结核患者中,其灵敏度优于结核抗体,两种方法联合应用对结核病血清学诊断具有辅助诊断价值。