缺氧诱导因子-1α及Foxp3在结直肠癌组织中的表达及临床意义

孙艳丽,陈 飞,陈 武

(吉林省肿瘤医院 1.内二科；2.核医学科,吉林 长春130012)

近年来靶向肿瘤微环境成为肿瘤治疗的新途径,肿瘤微环境是由低氧、低PH和大量生长因子等构成的一个复杂系统。缺氧诱导因子1α被发现在多种恶性肿瘤组织过表达,是肿瘤适应缺氧微环境的重要调控因子。调节性T细胞是目前发现一种具有免疫抑制功能的重要细胞亚群,发现其在多种恶性肿瘤组织内浸润,被认为可促使肿瘤发生免疫逃逸,与肿瘤进展及预后密切相关。叉头状螺旋转录因子(Foxp3)被认为是调节性T细胞的特异性标志物。本课题通过免疫组化方法研究结直肠癌患者组织内缺氧诱导因子-1α及Foxp3的表达情况,分析其相关性以及探讨两者表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2014年1月至2015年1月行手术切除的结直肠癌组织标本60例,所有结直肠癌患者术前均未行放、化疗或免疫靶向治疗,同时另取距离组织边缘6 cm非肿瘤的癌旁组织石蜡标本为对照。其中男性38例,女性22例；年龄39-75岁(中位59岁)；术后病理诊断分期：T1+T2期28例,T3+T4期32例；Ⅰ+Ⅱ患者27例,Ⅲ+Ⅳ期患者33例；肿瘤分化程度：高中分化36例,低分化24例。

1.2 免疫组化染色

结直肠癌组织,癌旁组织均用4%多聚甲醛固定,常规脱水、浸蜡、包埋、切片,然后常规脱蜡水化,采用SP法检测组织中Foxp3和HIF-1α蛋白表达水平,DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片,光镜下观察结果,结果判断由两名病理科医师阅片,阳性细胞胞浆或胞核染成棕黄色。主要抗体包括：鼠抗人Foxp3单克隆抗体(Life Span Bioscience公司,美国),兔抗人HIF-1α单克隆抗体(英国Biorbyt公司)。

1.3 结果判断标准

免疫组化染色结果所有病理染色切片均有两名病理科医师参照相关免疫组化反应结果的判断标准对免疫组化结果进行判定,以细胞出现棕黄色颗粒为阳性结果。采用半定量法依照染色强度及染色细胞百分比进行判定。染色强度计分方法：无阳性染色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分；阳性染色细胞构成比计分方法：无阳性染色细胞0分,阳性细胞百分比≤10%为1分,阳性细胞百分比11%-50%为2分,阳性细胞百分比51%-75%为3分,阳性细胞百分比>75%为4分。最终评分为染色强度分数与阳性细胞百分比分数的乘积。≥4分,则代表阳性表达。

1.4 统计学分析

应用SPSS17.0统计软件进行处理,Foxp3和HIF-1α在癌组织和癌旁组织的表达强度及结直肠癌病理程度的关系采用卡方检验,Foxp3和HIF-1α的表达相关性分析采用Spearman相关分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Foxp3和HIF-1α在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达Foxp3在肿瘤间质淋巴细胞胞核中表达,核内出现棕黄色颗粒为Foxp3阳性细胞。HIF-1α主要着色于肿瘤细胞核内及部分细胞质内,以细胞出现棕黄色颗粒为阳性结果,见图 1。

结直肠癌组织中Foxp3的阳性表达率68.3%(41/60),HIF-1α的阳性表达率63.3%(38/60),相比于癌旁组织,均显著上升,差异有统计学意义(P<0.01),见表 1。

A：癌组织Foxp3表达。B：癌组织HIF-1α表达。C：癌旁组织Foxp3表达。D：癌旁组织HIF-1α表达。

表1 60例Foxp3和HIF-1α在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达[例(%)]

2.2 结直肠癌患者组织中Foxp3和HIF-1α表达与临床病理因素的关系结直肠癌组织中Foxp3的阳性表达率与肿瘤的分期、浸润深度和淋巴结转移有关,肿瘤分期为Ⅲ期/Ⅳ期,肿瘤浸润深度为浆膜下和浆膜及浆膜外,以及淋巴结转移的结直肠癌组织中的Foxp3阳性表达率高于肿瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期、肿瘤浸润深度为粘膜下层和肌层,以及淋巴结未转移的结直肠癌组织,差异有统计学意义(P<0.05),而与性别、年龄、分化程度无关。见表2。

结直肠癌组织中HIF-1α的阳性表达率与肿瘤的分期、分化程度和淋巴结转移有关,肿瘤分期为Ⅲ期/Ⅳ期,分化程度差,以及淋巴结转移的结直肠癌组织中的HIF-1α阳性表达率高于肿瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期、分化程度好,以及淋巴结未转移的结直肠癌组织,差异有统计学意义(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤浸润深度无关。见表2。

表2 60例结直肠癌组织中Foxp3和HIF-1α的表达与临床病理因素的关系[例(%)]

2.3 结直肠癌组织中Foxp3和HIF-1α表达的相关性在结直肠癌组织中免疫组化染色中,Foxp3和HIF-1α的表达呈显著正相关性(r=0.409P<0.01)。见表3。

表3 60例结直肠癌组织中Foxp3和HIF-1α表达的相关性(例)

3 讨论

近年来靶向肿瘤微环境成为研究的热点,肿瘤微环境主要通过诱导新生血管形成,抑制免疫监视和免疫反应,孕育肿瘤干细胞等促进肿瘤发生及转移。肿瘤微环境调控着肿瘤的多种生物学行为,包括肿瘤复发和转移。

由于肿瘤细胞的快速增殖和高代谢状态,导致肿瘤供血供氧相对不足,缺氧成为肿瘤组织中的常见现象,此时,肿瘤会作出一系列生物学行为改变以适应缺氧的环境,缺氧诱导因子-1 (hypoxiainducible factor 1,HIF-1)就是启动这一系列适应性改变的一个重要因子。HIF-1α 为HIF-1所特有,它既是调节亚基也是功能亚基,决定HIF-1 的活性。缺氧应激引起HIF-1α的聚集、活化,活化的HIF-1通过与相应的靶基因序列结合调控多种缺氧反应基因的表达,以维持肿瘤的细胞的自身氧稳态及能量代谢平衡,在肿瘤的发生发展中起着极为重要的作用。

HIF-1α 在人类多种肿瘤中高表达,早期临床研究报道HIF-1α在13 种实体肿瘤中高表达[1]。此后陆续报道了在食管癌[2]、胃癌[3]、前列腺癌、乳腺癌[4]、卵巢癌[5]等一系列恶性肿瘤中HIF-1α的高表达。本研究中结直肠癌组织中HIF-1α的阳性表达率63.3%,显著高于癌旁组织(P<0.01),与临床报道相符[6]。此外本研究证实结直肠癌组织中HIF-1α阳性表达率与患者性别、年龄、肿瘤浸润深度无关,而与肿瘤的分期、分化程度和淋巴结转移有关；肿瘤分期为Ⅲ期/Ⅳ期,分化程度差,以及淋巴结转移的结直癌组织中的HIF-1α阳性表达率高于肿瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期、分化程度好,以及淋巴结未转移的结直肠癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。

调节性T 细胞(regulatory T cells,Tregs)是一类具有免疫抑制功能的T 细胞亚群。调节性T 细胞可分为多种亚型,其中最重要也是目前研究最多的为表达叉头状螺旋转录因子FOXP3 的天然调节性T 细胞及诱导调节性T 细胞。转录因子Foxp3是forkhead/ winged-helix 转录因子家族中的一员。作为重要转录因子对调节性T细胞的形成及免疫抑制功能起到至关重要的作用。Foxp3 是CD4+CD25+Treg 细胞的特异性标志,是参与肿瘤微环境中抑制免疫应答的重要调节基因。

本研究结果表明Foxp3在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.01),Foxp3阳性表达率68.3%,与临床报道大致相符[7]。本研究证实随着结直肠癌组织浸润深度增加,淋巴结转移和肿瘤分期增加,Foxp3表达进一步增加,而与性别、年龄、肿瘤分化程度无关。结直肠癌患者Foxp3阳性表达与肿瘤微环境的免疫抑制相关,随着肿瘤的进展及病变范围扩展,肿瘤细胞更易与机体免疫细胞直接作用或通过细胞因子介导的间接接触,可能刺激CD4+ CD25+T细胞转化为Treg,使Foxp3在肿瘤组织中呈高表达的同时介导并增强Treg细胞的抑制功能,加深患者体内免疫细胞对肿瘤的免疫耐受,促进了肿瘤的生长和转移[8]。因此,本研究结果表明,随着结直肠癌分期越晚,Foxp3表达越增加,免疫抑制越严重。

此外本研究分析发现结直肠癌组织中Foxp3和HIF-1α表达成正相关。且随着结直肠癌组织出现淋巴结转移和肿瘤分期增加,Foxp3和HIF-1α表达进一步增加,故联合检测Foxp3和HIF-1α在结直肠癌组织中的表达,有助于判断结直肠癌转移潜能及评估结直肠癌患者的预后。