小檗碱对高糖高脂饲料联合链脲佐菌素诱导的糖尿病心肌病大鼠的保护作用

霍梦露，王瑞瑶，李超，关锡梅，倪伟建，唐丽琴

[1.安徽中医药大学药学院，合肥 230031;2.中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)药剂科]

糖尿病心肌病(DCM)糖尿病心肌病不加干预最终可发展成为心力衰竭、心律失常及心源性休克，是造成糖尿病患者高致死和致残率的重要因素之一，因此积极的预防和治疗糖尿病心肌病对糖尿病患者有着迫切的现实意义[1]。黄连是我国的常用中药，古时常用于痢疾等胃肠道感染和消渴症即糖尿病的治疗。小檗碱(BBR)作为黄连的主要有效成分，已被现代动物实验和临床观察证实可以降低血糖、降低血脂、改善胰岛素抵抗，对2型糖尿病有积极的治疗作用[2-3]，在糖尿病心肌病方面，课题组前期预实验表明小檗碱可以降低糖尿病心肌病大鼠的血糖和血脂。本实验将在预实验的基础上，通过检测糖尿病心肌病大鼠心肌酶以及使用超声心动图法比较大鼠心脏结构和功能的变化，进一步观察小檗碱对糖尿病心肌病大鼠心脏的作用。

1 材料与方法

1.1 动物及饲喂 清洁级雄性SD大鼠由安徽医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：scxk (皖)2017-001，饲喂于中国科学技术大学附属第一医院动物房，喂养时保持环境安静，温度控制在20～25 ℃，相对湿度控制在40%～70%，保持通风良好。实验时间为2018年4月至10月。

1.2 试剂 高糖高脂饲料(20%蔗糖，10%猪油，6%蛋黄粉，0.5%胆盐，63.5%基础饲料[4])，由安徽中医药大学实验动物中心提供；链脲佐菌素(STZ)购自美国 Sigma-Aldrich 公司；BBR由中国科学技术大学附属第一医院药学实验室提供；盐酸二甲双胍片(中美施贵宝公司生产)；盐酸曲美他嗪片(天津施维雅公司生产)。

1.3 主要仪器 ME204E电子分析天平，Mettler Toledo 公司；ACS-DⅡ计重秤，上海乾峰电子仪器有限公司；SC-3610离心机，安徽中科中佳仪器有限公司；DMI3000B荧光倒置显微镜,德国莱卡；小动物超声装置vevo2100，加拿大Visual sonic公司；血糖检测系统，湖南三诺生物传感公司；日立全自动生化分析仪7600型，日立公司。

1.4 方法

1.4.1 模型的建立及指标检测 雄性SD大鼠36只，按照随机数字表法分为健康对照组(NC，n=6)和高糖高脂组(n=30)。

对照组大鼠以普通饲料喂养，高糖高脂组大鼠则喂以高糖高脂饲料，6周后，高糖高脂组的大鼠腹腔注射给药STZ 30 mg/kg，(STZ溶液溶剂为pH 4.2～4.5枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，避光，现配现用)，对照组注射等剂量的缓冲盐溶液，3 d后和7 d后，禁食12h检测大鼠的空腹血糖(FBG)，以连续2次血糖≥11.1 mmol/L视为糖尿病模型成功[5-6]，未成模大鼠再适量补充注射STZ，继续高糖高脂饮食喂养12周成糖尿病心肌病模型。

模型大鼠随机分为糖尿病心肌病模型组(DCM组，6只)，二甲双胍组(二甲双胍 200 mg/kg，6只)，曲美他嗪组(曲美他嗪 10 mg/kg，6只)，小檗碱低剂量组(BBR 100 mg/kg，6只)，小檗碱高剂量组(BBR 200 mg/kg，6只)。实际使用共30只模型大鼠及6只未建模对照鼠。

本实验采用预防性给药，即造成糖尿病模型开始给药，持续12周。药物均使用0.5%羧甲基纤维素钠作为溶媒，每组按所示药物种类和剂量进行灌胃，DCM组和NC组均以相同给药途径给予等量的溶媒，灌胃期间健康对照组以普通饲料喂养，其余各组继续喂高糖高脂饲料。

1.4.2 超声心动图检测大鼠心脏功能 灌胃给药12周结束，对大鼠进行超声心动图检测。将大鼠左胸前区域进行脱毛后，持续性用异氟烷(已使用雾化罐将其转化为可吸入性气体)麻醉，仰位固定于检查台上，台温设定为37℃[7]，使用超声探头寻找大鼠心脏胸骨旁左室长轴切面，左室短轴切面以及四腔心切面，分别保存长轴切面的B-MODE模式，短轴切面的M-MODE和四腔心切面的彩色多普勒模式下的动态图像，所得图像可使用仪器的所安装的vevo 2100系统分析获得大鼠的左心室射血分数(LVEF)，短轴收缩率(FS),E/A比值指标[8-10]。

1.4.3 大鼠血糖血脂和心肌酶的检测 超声心动图检测完毕后，大鼠禁食12 h，腹主动脉取血，3700 r/min,10 min，收集上层血清，采用全自动生化分析仪检测血清中的肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)[11-12],三酰甘油(TG)，胆固醇(TC)以及空腹血糖FBG的含量[13]。

1.4.4 计算心脏质量与体质量比(HW/BW) 大鼠处死前称重，记录下体质量(BW)，腹主动脉采血后，取下心脏使用冷的PBS清洗残余血液，剪去多余的结缔组织，天平称心脏质量(HW)。计算HW/BW。

1.4.5 心脏组织的病理学检测 沿心脏左心室横切，将横切面至心脏基底方向组织置于10倍体积的4%多聚甲醛中固定48 h后，石蜡包埋，切片，进行HE染色和Masson染色，显微镜观察心肌组织切片病理变化[14]。

2 结果

2.1 动物一般情况观察 实验期间，NC组大鼠皮毛光洁，尾巴完整并呈现出健康粉红色，精神状况较好，DCM组大鼠毛发较脏，发暗发灰，烂尾，尿液中有糖类结晶析出，行动迟缓，有部分大鼠眼睛出现白色阴翳，BBR组和TMZ组相较于DCM组大鼠，毛色和精神状态有明显好转。

2.2 HW/BW 相较于NC组，DCM组大鼠心脏质量与体质量比显著升高(P<0.05)，提示DCM组已经发生了心脏的肥大病变；二甲双胍组HW/BW相较于DCM组，比值有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05),BBR高剂量组和TMZ组心脏质量占比与DCM组相比下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示BBR和TMZ对大鼠的心肌肥厚有抑制作用。见表1。

表1 小檗碱对糖尿病心肌病大鼠心脏质量/体质量的影响

注：与健康对照组比较，aP<0.05;与糖尿病心肌病模型组比较，bP<0.05

2.3 大鼠血糖血脂和心肌酶的检测结果 DCM组大鼠的FBG、TG、TC含量显著高于NC组(P<0.05)，这与文献报道的糖尿病心肌病大鼠的特征相符，CK、LDH、AST值也呈现相同趋势(P<0.05)；二甲双胍可明显降低大鼠血清中FBG、TC、AST(P<0.05)的含量而对其余指标无明显影响。TMZ无法缓解糖尿病引起的高血糖(P>0.05)，高胆固醇(P>0.05)和高三酰甘油(P>0.05)症状，但可以减少心肌酶CK、LDH和AST(P<0.05)释放入血的量；BBR高剂量组给药12周后，与DCM组相比，高剂量组空腹血糖、三酰甘油、胆固醇、肌酸激酶、乳酸脱氢酶(P<0.05)都明显降低，天冬氨酸氨基转移酶的含量也有所下降(P<0.05)，低剂量组给药组各指标水平也均下降，但仅TC、CK、LDH(P<0.05) 的水平与DCM组有差异，提示BBR对糖尿病心肌病的大鼠具有保护作用且呈一定的剂量相关性。见表2。

2.4 超声心动图检测大鼠心脏的功能结果 临床上常用来评价心脏收缩功能的主要有两个指标：左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS),LVEF是指每搏输出量占心室舒张末期容积量的百分比，FS是指左心室舒张末期内径与收缩期内径之差占左心室舒张末期内径的百分比。E/A比值是心脏左心室舒张功能的标志。它表示舒张前期重力引起的从心房到心室血流的峰值流速(E波)与后期心房收缩引起的峰值流速(A波)之比。根据心脏短轴切面获得M-mode图像分析统计EF和FS值，四腔心切面的彩色多普勒图像分析E/A值，具体结果如下图3，与NC组相比，DCM组大鼠的LVEF，FS，E/A比值(P<0.05)下降,提示糖尿病心肌病模型组大鼠心肌已经出现了收缩和舒张功能的损伤；二甲双胍组的LVEF，FS，E/A有轻微的提升，但与DCM组差异无统计学意义(P>0.05)；TMZ提高心脏功能的作用较为显著，LVEF，FS和E/A(P<0.05)值与DCM组比较上升明显；BBR低剂量组可提高EF值(P<0.05),而高剂量组可以改善心脏的LVEF，FS，E/A(P<0.05)，提高心脏的收缩的舒张功能。见表3。

2.5 HE染色和Masson染色结果 HE染色中心肌纤维红染，细胞核蓝染，从图1可看出NC组鼠心肌纤维形态均匀，排列规律紧密，细胞核蓝染清晰可见；DCM组心肌排列疏松紊乱，肌纤维肥大断裂，有空泡样变性，细胞核深染；二甲双胍组，TMZ组和BBR组经药物治疗后，心肌损伤情况有不同程度的改善，心肌排列较DCM组规则且细胞核清晰可见。

Masson染色可直观显示出心肌组织内胶原沉积情况，肌纤维经着色后成红色，胶原纤维呈蓝色。NC组大鼠心脏胶原组织分布均匀，含量适宜，血管周围纤维化程度较轻；DCM组大鼠可见蓝染部分即胶原组织明显增多，相互连接成网状，排列紊乱，分布不均，血管周围纤维组织明显增多；各给药组心肌纤维化情况均有所改善，以TMZ组效果最佳，BBR高剂量和低剂量组也显示出了抗纤维化的作用。见图2。

表2 小檗碱对大鼠血清血脂和心肌酶指标的影响

注：FBG为空腹血糖，TG为三酰甘油，TC为胆固醇，CK为肌酸激酶，AST为天冬氨酸氨基转移酶，LDH为乳酸脱氢酶；与健康对照组比较，aP<0.05;与糖尿病心肌病模型组比较，bP<0.05

表3 小檗碱对糖尿病心肌病大鼠心脏功能的影响

注：与健康对照组比较，aP<0.05;与糖尿病心肌病模型组比较，bP<0.05

图1小檗碱对心肌组织的影响(HE染色，200×)。A：健康对照组，B：糖尿病心肌病模型组(红色箭头处肌纤维断裂，黑色箭头处细胞核呈空泡样改变)，C：二甲双胍组，D：曲美他嗪组，E：小檗碱低剂量组(100 mg/kg)，F：小檗碱高剂量组(200 mg/kg)

图2小檗碱对心肌组织纤维化的影响(Masson染色，200×)。A：健康对照组，B：糖尿病心肌病模型组(黑色箭头所指示为血管，红色箭头所指示为胶原纤维)，C：二甲双胍组，D：曲美他嗪组，E：小檗碱低剂量组(100 mg/kg)，F：小檗碱高剂量组(200 mg/kg)

3 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病的慢性并发症之一，现糖尿病心肌病的动物造模多采用先高糖高脂饲料加上小剂量的注射STZ建立糖尿病模型[15]，再继续高糖高脂饲料喂养6～16周时间以诱导出糖尿病心肌病，目前糖尿病心肌病模型的验证尚无统一定论，主要集中在血糖血脂水平的检测，大鼠心脏功能的评价以及病理切片染色观察等方面，本实验结合了急性心肌梗死死心肌细胞释放入血的心肌酶谱，在常规的血糖血脂指标检测的基础上考察了CK、LDH、AST的含量，并使用无创的超声心动图进一步验证实验结束时糖尿病心肌病模型建立的成功与否以及小檗碱对糖尿病心肌病大鼠的保护作用。

CK、LDH、AST是心肌细胞胞内酶，亦是属于心肌酶谱的酶类，在正常状态时催化细胞的代谢活动，当心肌细胞受到损伤发生坏死时，可破裂释放入血，血液中含量增加，因此，临床上一般用心肌酶的水平来间接衡量心肌细胞的损害程度。非侵入式超声心动图作为临床上检测心脏功能的常用手段，受限于仪器昂贵的成本，近些年才在动物实验中普及开，其相较于之前常采用的左心室插管测定血流动力学指标的方法，具有无创性、直观性、节约样本量的优点。本研究从超声心动图所获得的心脏信息中选取较为常用的收缩功能指标(EF和FS)，舒张指标(E/A)，通过数理统计分析的方法比对模型组与对照组的，给药组和模型组的数据得出造模和药物干预得结果。

本实验采用高糖高脂饮食喂养6周后小剂量注射STZ并继续高糖高脂喂养12周成功复制出糖尿病心肌病的大鼠模型。小檗碱给药12周后可降低大鼠的血糖、血胆固醇和三酰甘油、心脏质量与体质量比，其中高剂量干预组与模型组差异有统计学意义，与本课题前期的预实验结果相一致。小檗碱高剂量组也能显著性地降低血清中CK、LDH、AST的含量，显示出了对心肌细胞的保护作用，糖尿病心肌病大鼠的收缩和舒张功能经过灌胃给药小檗碱后，也有显著性提高，HE和Masson特异性染色可看出小檗碱给药组心肌纤维化降低，肌纤维排列紧密，有序化程度升高，细胞核均匀分布，染色深浅适宜。因此可得出结论，小檗碱对糖尿病心肌病大鼠的心肌和心脏功能具有一定的保护作用，这种保护作用可能与调节AMPK相关信号转导通路有关。