载脂蛋白E基因多态性与心脑血管疾病患者C反应蛋白水平相关性分析

国希云，王曙霞，邓娴，唐果，何荆贵

(中国人民解放军总医院第一医学中心干部诊疗科,北京 100853)

载脂蛋白E(ApoE)最早发现于1973年，是从极低密度脂蛋白(VLDL)中发现的，后来在所有哺乳动物的乳糜微粒(CM),低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)相继被发现，目前已经确定ApoE的生理功能是主要作为LDL和CM受体的配体，参与脂蛋白的代谢。既往研究发现，ApoE基因rs7412 和 rs429358多态性与心脑血管发病密切相关，ApoEε4携带者心脑血管风险明显增高[1-3]，但其机制目前尚不十分明确，本研究拟通过研究ApoEε4携带者与超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平之间的关系，探讨炎症在ApoEε4携带者心脑血管疾病发病方面的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 心脑血管疾病组： 连续入选我院2016年4月至2017年3月门诊就诊的心脑血管疾病患者278例(其中冠心病患者160例，缺血性脑卒中患者118例)。其中男208例，女70例，年龄(67.6±8.7)岁。对照组： 同期在我院进行体检的健康对照人群236例，其中男165例，女71例，年龄(66.9±8.8)岁。两组患者的年龄、性别、文化程度等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 所有受试者均禁食≥ 12 h，次日清晨抽取肘静脉血10 mL，其中一部分血液标本用于生化检测，其余部分加入乙二胺四乙酸二钠抗凝，-20 ℃ 保存，采用分离白细胞，低渗溶血，常规酚一氯仿法提取DNA，EDTA抗凝。

1.2.2 ApoE基因多态性检测 引物为：5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’，5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’，PCR反应参数为：取PCR产物5 μL，加HhaⅠ酶3 u，37 ℃酶切5 h，用2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。结果可显示PCR产物为244 bp，被酶切为91 bp和83 bp的片段为ε2基因，被酶切为91 bp和48 bp的片段为ε3基因，被酶切为72 bp和48 bp的片段为ε4基因。

1.2.3 CRP检测 采用生化全自动仪分别对三酰甘油(TG)，总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),空腹血糖和血清hs-CRP 水平等进行测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计学软件进行分析。计数资料以例数及率表示，比较采用χ2检验。计量资料均行正态性检验，正态资料的组间比较采用成组t检验，偏态资料的组间比较采用秩检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床情况 心脑血管疾病组与对照组的临床一般情况及血脂、血糖、血压，见表1。心脑血管疾病组的收缩压高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。年龄、血脂等指标两组间差异无统计学意义。

2.2 ApoE基因型频率比较 ApoE基因型频率基本符合Hardy-Weinberg平衡，对照组ApoEε2,ApoEε3和ApoEε4基因分别占20.8%,75.0%和4.2%,心脑血管疾病组ApoEε3频率为74.1%，与对照组之间大体相近，心脑血管疾病组ApoEε4基因频率为14.7%，明显高于健康对照组，而心脑血管疾病组ApoEε2基因频率为11.2%，明显低于健康对照组。见表2。

表1 心脑血管疾病组与健康对照组一般情况比较

表2 心脑血管疾病组与健康对照组ApoE基因频率对比

2.3 不同基因型hs-CRP比较 心脑血管疾病组的hs-CRP水平显著高于对照组(P<0.05)，心脑血管疾病组ApoE各基因型的hs-CRP水平均较对照组增高，但ApoEε3和ApoEε2在两组间差异无统计学意义。心脑血管疾病组ApoEε4水平较对照组差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 心脑血管疾病组与健康对照组不同ApoE基因型hs-CRP对比

注：两组比较采用成组秩检验

3 讨论

ApoE是由299个氨基酸残基构成，当其112位和158位全是半胱氨酸时，就是E2型的异构体，当这两个位置全是精氨酸时就是E4型异构体。当112位是半胱氨酸，158位是精氨酸是就是E3型的异构体。有的人体内只有一种异构体，就是纯合子，像E2E2，E3E3，E4E4。有的人体内含有两种异构体，就是杂合子E2E3，E2E4，E3E4[4]。

体内所含有的异构体类型是和基因型相对应的，决定人们载脂蛋白E型别的基因位于19号染色体上，有三个等位基因共同表达ε2，ε3，ε4。因此，又可将6种异构体型别划分为三个大的表型，即ApoE2，E3，E4表型。相应的不同的表型有不同的特性，E3型为野生型，占到70%～80%，E2，E4型通常称为变异性，或者突变型。

E2型占自然人群的5%～10%。E2型携带者不易患神经退化性疾病，像阿尔茨海默病、帕金森病，也不容易患心肌梗死、脑梗死等心脑血管疾病；E4型的突变携带者易患老年痴呆，帕金森综合征等神经退化性疾病，也是高血脂、动脉硬化、心肌梗死、脑梗死等心脑血管疾病的易感人群，占10%～15%。既往研究将大鼠体内的ApoE基因敲除，然后给予大鼠正常的饮食，大鼠会罹患严重的动脉粥样硬化，由此推测，ApoE的ε4等位基因可能是导致动脉粥样硬化的独立因素[5-7]。本研究中，心脑血管疾病患者ApoE的ε4等位基因频率显著高于对照组。ApoEε4携带者心脑血管患病风险明显增高，但其机制目前尚不十分明确。

hs-CRP是由肝细胞产生的一种炎症和组织损伤急性期反应的非常敏感的标志物，动脉硬化是一系列病因所致炎性反应引发炎性细胞和介质造成动脉壁损坏所引起。CRP可诱导单核细胞表达组织因子，激活凝血系统和补体系统导致机体凝血与纤溶失衡，从而增加心血管事件的危险[8-11]。本研究通过发现心脑血管疾病组ApoEε4携带者的hs-CRP水平增高，提示ApoEε4携带者体内炎症水平增高，可能是其导致心脑血管疾病增加的机制之一。但本研究亦有较明显的不足：样本量较少，缺乏对ApoEε4携带者体内炎性水平地更深入研究。

综上所述，载脂蛋白E4等位基因在心脑血管疾病患者中的比例较高，同时携带ApoEε4基因型的患者血浆hs-CRP 水平增高，ApoEε4患者体内炎症水平较高，可能是导致其心脑血管疾病发病率增高的原因之一。