钝化膜水解菌筛选及其协同零价铁去除Cr(VI)的研究

(绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000)

我国是铬盐生产大国,铬(Cr)及其化合物广泛应用于印染、电镀、制革和冶金等行业,由此产生大量的铬渣[1].铬渣的无序堆放和不恰当处置造成了严重的土壤和地下水污染,从而影响动植物生长,威胁人体健康[2].因此有效治理土壤和地下水中的铬污染是一项非常紧迫的工作.

铬的处理技术主要有光催化还原、膜分离、电化学、吸附、生物修复和化学还原等[3].光催化还原法的特点是清洁、无二次污染,但在实际处理过程中，由于电子与空穴复合效率偏高导致对光能的利用率偏低[4].膜分离技术效率高，装置简单,处理后的出水可直接循环利用；但该技术不能直接去除铬,往往需要对废水进行预处理或者与其他方法联用,同时膜污染问题也有待解决[5].电化学法产生的污泥量少,无须长期消耗化学试剂,但是需要外加电源,因此能耗大且成本高[6].吸附法具有很好的选择性,但吸附容量低,只适合处理低浓度的含铬废水,难以在工业化生产中应用[7].生物修复技术成本低、环境友好,但是反应速率不高,单一微生物在环境中难以成为优势菌发挥作用[8].

化学还原法反应迅速且操作简便,是水中铬处理最典型的方法[9].它是利用化学还原剂将毒性高的Cr(VI)还原为毒性低的Cr(III),再以沉淀的方式从水中去除[10].其中零价铁因其具有廉价易得、反应效率高以及可去除多种污染物等优点,近些年被广泛应用于Cr(VI)的处理[11].但铁在制备和除污过程中,由于空气氧化会形成一层氧化膜,覆盖在零价铁的表面形成钝化膜,从而阻止了零价铁与污染物的进一步反应，减少其活性位点[12].

目前，主要采用化学和物理的方法来缓解零价铁钝化问题，包括酸洗和氢气或硼氢化钠还原[13]、电化学法[14]、 超声法[15]以及磁场法[16].以上方法因成本高、反应速率低以及产生二次污染等未能广泛应用于实际污染的治理中.微生物修复是一种环境友好、成本低的处理技术，若能采用具有产酸能力的微生物来水解零价铁表面的Fe(II)/Fe(III)氧化膜，则可有效消除钝化作用，释放零价铁活性位点，提高零价铁的还原能力，且不产生二次污染.但是，目前利用微生物解决零价铁表面钝化膜的研究非常少.

基于上述背景，本研究拟利用具有产酸能力的微生物来水解零价铁表面的钝化膜，以提高零价铁的反应速率.首先筛选具有水解钝化膜能力的微生物，优化水解条件，在此基础上考察微生物对零价铁去除Cr(VI)过程的加速作用，并分析水解菌协同零价铁去除水中Cr(VI)的机理.

1 实验材料与仪器

1.1 菌种

菌种Shewanellaoneidensis(ATCC 700550)、Shewanelladecolorationis(JCM 21555)和Shewanelladecolorationis(MCCC 1A11454)购买于中国海洋微生物菌种保藏中心,活化后保存为LB斜面.菌种Lysinibacillussp.VKM B-713、Lysinibacillussp.JLT12、Morganellamorganiisubsp、BacteriumL9和SerratiamarcescensstrainSW-4分离于城市污水厂厌氧处理单元，鉴定后保存于LB斜面.上述菌种分别标记为菌1—菌8.

1.2 试剂与仪器

重铬酸钾 (K2Cr2O7) 购于上海金联精细化工厂，零价铁购于上海化学试剂采购供应站，其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司.采用日本电子株式会社(JEOL)的JSM-6360LV型扫描电子显微镜观察颗粒形貌,并用英国牛津 X-act能谱仪进行元素分析.采用美国Leeman公司Prodigy xp电感耦合等离子体发射光谱仪 (ICP-AES) 测定溶液中的总铬(Cr).

2 钝化膜水解菌的筛选实验

配置浓度为50 mg/L的K2Cr2O7营养盐培养基,分装于24瓶250 mL锥形瓶中,每瓶100 mL.营养盐配方如下:葡萄糖为10 g/L,NaHCO3为2.5 g/L,NH4Cl为0.25 g/L,KCl为0.1 g/L,NaCl为0.1 g/L,MgCl2·6H2O为0.2 g/L,KH2PO4为0.04 g/L,酵母粉为1 g/L.营养盐培养基于115 ℃灭菌20 min.无菌条件下向100 mL营养盐培养基中加入0.2 g零价铁,将24瓶锥形瓶分为8组,每组3个平行,分别接入2 mL菌1—菌8新鲜种子液进行实验,以此时为实验起点.实验0 h时,摇匀后取样2 mL,于8 000 r/min离心10 min,采用二苯碳酰二肼分光光度法测定上清液中Cr(VI)的初始浓度C0.之后,分别将锥形瓶于厌氧(通N2驱氧、静置)、缺氧(静置)及好氧(150 r/min震荡)三种条件下30 ℃培养48 h;每隔24 h取样2 mL,测定溶液的pH值,且于8 000 r/min离心10 min后,测定上清液中Cr(VI)含量.采用下式计算去除率:

Cr(VI)去除率=(C0-Ct)/C0×100%.

(1)

其中C0和Ct分别为0 h和t时刻测得的Cr(VI)的浓度.

实验所选菌种分别协同零价铁去除水中Cr(VI)的结果如图1所示.由图1可见，好氧条件下,菌5协同零价铁去除Cr(VI)的去除率明显高于其他7株菌种,可达到100%;缺氧条件下,菌5、菌6和菌8协同零价铁去除Cr(VI)的去除率达到100%;厌氧条件下,菌1和菌3协同零价铁去除Cr(VI)的去除率达到100%.但是据报道,兼性和厌氧条件下,反应以微生物还原为主[18],而好氧条件下除了吸附,可能存在微生物对钝化膜的水解作用.故选择菌5(Lysinibacillussp.JLT12)为目标菌种,进行水解菌协同零价铁去除水中Cr(VI)条件优化实验.与厌氧还原菌相比,水解菌不要求严格的厌氧环境,在好氧和缺氧环境中都有较高的水解效率,适应性强.

3 水解菌协同零价铁去除水中Cr(VI)条件优化

碳源和氮源是微生物生长发育的重要营养来源，其主要作用是为微生物的生长代谢提供能量.利用水解菌的产酸作用去除零价铁表面钝化膜时,水解菌培养基中的碳源、氮源和溶液的pH值对水解菌的生长、产酸能力有显著影响,进而影响水解菌的协同作用效果.因此，本研究对培养基中的碳源、氮源和pH值进行优化,以获得对Cr(VI)的最佳去除效果.

3.1 不同碳源及浓度的影响

在100 mL培养基 +2 mL新鲜水解菌种子液+0.2 g零价铁中,分别加入等量且相同浓度(5 g/L)的葡萄糖、乙酸钠、蔗糖和可溶性淀粉作为碳源,于30 ℃、150 r/min震荡培养48 h,每24 h取样,离心测定上清液中Cr(VI)的含量,研究不同碳源对Cr(VI)去除率的影响.

不同种类的碳源及浓度对Cr(VI)去除率的影响见图2.由图2(a)可见,不添加碳源体系中的Cr(VI)去除率最低,而葡萄糖体系中的Cr(VI)去除率最高.此外,碳源浓度同样影响Cr(VI)的去除效率,葡萄糖体系的最佳浓度为8 g/L,见图2(b).

3.2 不同氮源及浓度的影响

在100 mL培养基+2 mL新鲜水解菌种子液+0.2 g零价铁中,分别加入等量且相同浓度(5 g/L)的酵母粉、蛋白胨和氯化铵作为氮源,于30 ℃、150 r/min震荡培养48 h,每24 h取样,离心测定上清液中Cr(VI)的含量,研究不同氮源对Cr(VI)去除率的影响.

图1 不同条件下菌种协同零价铁去除Cr(VI)的效率对比

图2 不同碳源及浓度的影响

图3 不同氮源及浓度的影响

不同种类的氮源及浓度对Cr(VI)去除率的影响见图3.由图3(a)可见,当酵母粉作为氮源时,48 h时Cr(VI)的去除效率可以达到100%；而酵母粉的最佳添加量为10 g/L,见图3(b).3.3pH值的影响

在100 mL培养基 +2 mL新鲜水解菌种子液+0.2 g零价铁体系中,调节其pH值分别为4、5、6、7和8,于30 ℃、150 r/min震荡培养48 h,每24 h取样,离心测定上清液中Cr(VI)的含量,研究不同pH值对Cr(VI)去除率的影响.

不同pH值对Cr(VI)去除率的影响见图4.由图4可见,pH值范围在6～8之间时,体系中Cr(VI)的去除率均较高,其中pH=7时效率最高.

3.4 讨论

Banerjee等[18]直接利用从含Cr废水中分离出的Rhodococcuserythropolis还原Cr(VI),分别

图4 不同pH值对Cr(VI)去除率的影响

研究了碳源、pH值、温度、初始Cr(VI)浓度、底物和氧气对Cr(VI)去除效率的影响.研究结果表明：当葡萄糖作为碳源时,R.erythropolis的生长受到抑制,推测Cr(VI)会影响葡萄糖的代谢,而小分子量的碳源,如乳酸则不受Cr(VI)的影响.Cr(VI)初始浓度小于30 mg/L时,R.erythropolis对其去除率为100%,大于30 mg/L后,Cr(VI)的去除效率降低,推测较大初始浓度的Cr(VI)对微生物的生长及还原能力产生了抑制作用.氧气、pH值和温度对R.erythropolis还原也有影响,转速为100 r/min、pH=5.0、温度为28 ℃时,Cr的去除率最高.

在本研究所选的几种碳源中，葡萄糖是Lysinibacillussp.JLT12生长和产酸的最佳碳源；而且当体系中的pH值为7.0时，Cr(VI)的去除效率最高，这可能与微生物类型有关.Lysinibacillussp.JLT12协同零价铁去除Cr(VI)的效率高于已报道的R.erythropolis,表明微生物与化学联合法可以显著提高Cr(VI)的去除效率.

4 水解菌协同零价铁去除水中Cr(VI)的动力学分析

4.1 一级、二级动力学分析

Ct/C0=exp(-k1t);

(2)

Ct=C0/(1+k2C0t).

(3)

式中:Ct为t时刻上清液中Cr(VI)的浓度；C0为0时刻上清液中Cr(VI)的浓度；k1和k2分别为一级和二级反应动力学常数；R1和R2分别为一级和二级反应动力学方程拟合系数.

图5为一级和二级反应动力学方程拟合曲线.由图5(a)可见,当溶液中Cr(VI)的初始浓度为110 mg/L时,Lysinibacillussp.JLT12协同零价铁体系可以显著提高Cr(VI)的去除率,反应72 h后,溶液中剩余Cr(VI)的浓度为22 mg/L,去除率为80%,而单一的零价铁和Lysinibacillussp.JLT12体系对Cr(VI)去除效率分别为23.5%和51.9%,两者之和小于80%,表明Lysinibacillussp.JLT12和零价铁共存时,对Cr(VI)去除不仅仅是简单的叠加作用,还存在协同促进作用.

汤洁等[19]利用铁屑和肠埃希氏菌在厌氧条件下协同还原去除Cr(VI),铁屑微生物还原去除Cr(VI)的最佳pH值为5.8,当Cr(VI)的初始浓度分别为30 mg/L、40 mg/L和50 mg/L时,反应Cr(Ⅵ)去除率分别为52%、31%和24%,即肠埃希氏菌受Cr(VI)较高浓度毒性影响还原能力减弱.而本研究中当Cr(VI)的初始浓度为110 mg/L时，零价铁和微生物的协同作用可以去除80%的Cr(VI).Lsinibacillussp.JLT12在好氧条件下对Cr(VI)有更强的吸附能力.

图5 一级和二级反应动力学方程拟合曲线

对该动力学过程以一级和二级动力学方程进行拟合,结果如表1所示.对零价铁和Lysinibacillussp.JLT12独立作用体系而言,二级动力学方程的拟合结果更好；而对Lysinibacillussp.JLT12与零价铁协同作用体系而言,一级动力学方程的拟合结果更好,说明两者共存时作用机理有所改变.一级动力学和二级动力学的拟合结果均显示,协同作用体系的反应速率较单独作用体系有显著提高.许多研究成果均表明,零价铁还原Cr(VI)的过程更符合二级动力学方程[1,11],且反应速率与剩余Cr(VI)浓度的二次方成正比；而协同作用时反应速率与剩余Cr(VI)浓度成正比.

4.2 伪一级、二级动力学分析

dq/dt=kα(qe-q);

(4)

dq/dt=kβ(qe-q)2.

(5)

式中:dq和dt分别为吸附量与时间的变化量；kα和kβ分别为伪一级和伪二级反应动力学常数；Rα和Rβ分别为伪一级和伪二级反应动力学方程拟合系数.

伪一级和伪二级动力学方程的拟合曲线见图6,拟合数据见表2.由图6和表2可见,伪一级和伪二级动力学方程对Cr(VI)去除过程的拟合结果均比较好,相关系数R2>0.98.拟合结果也表明,Lysinibacillussp.JLT12存在时,零价铁对Cr(VI)的去除量有很大的提高,饱和去除量由14.83 mg/g,提高至18.49 mg/g.推测Lysinibacillussp.JLT12可以水解零价铁表面的钝化膜,提高零价铁对Cr(VI)的去除效率.

5 水解菌协同零价铁去除水中Cr(VI)机理研究

配置100 mL浓度为400 mg/L的K2Cr2O7培养基,添加0.2 g零价铁,接种2 mL新鲜水解菌种子液，于30 ℃震荡培养72 h.每隔12 h取样测定pH值和Cr(VI)含量,采用ICP-AES法分析总Cr含量.采用Ferrozine法测定Fe(II)含量[17],经盐酸羟胺还原后测定总铁含量,计算Fe(III)含量.培养液取样,8 000 r/min离心10 min,弃去上清液,冷冻干燥后得到零价铁、微生物以及微生物/零价铁混合物. 采用SEM观察铁和微生物的微观结构,结合EDS能谱分析其元素组成.

图6 伪一级和伪二级反应动力学方程拟合曲线

5.1 pH值变化

Lysinibacillussp.JLT12体系和Lysinibacillussp.JLT12-零价铁体系在去除Cr(VI)的过程中pH值逐渐降低(图7),反应环境酸性增强,说明微生物在新陈代谢过程中会产生酸性物质,而这些酸性物质降低了系统内的pH值.在Lysinibacillussp.-零价铁协同去除Cr(VI)的体系中,pH值的降低有利于零价铁表面氧化膜和沉淀等的溶解,提高零价铁的还原活性,这也是协同作用pH值降低速率比微生物单独作用慢的原因.而在还原铁粉单独作用的体系中,可能因为腐蚀产氢等原因,其pH值在实验过程中有所上升并最终趋于稳定.在Lysinibacillussp.-零价铁协同作用体系中反应过程pH值的变化,证实了微生物能够促进零价铁表面氧化膜和沉淀的溶解.

图7 还原过程中pH值变化分析

2Cr3++3Fe2++8H2O(l);

(6)

2Cr3++3Fe2++8H2O(l);

(7)

Cr3++3Fe3++4H2O(l);

(8)

Cr3++3Fe3++4H2O(l);

(9)

(1-x)Fe3++xCr3++3H2O(l)→

CrxFe1-x(OH)3(s)+3H+;

(10)

(1-x)Fe3++xCr3++2H2O(l)→

CrxFe1-xOOH(s)+3H+.

(11)

从上述反应方程可以看出,零价铁还原Cr(VI)是消耗H+的过程,H+的存在一方面可以促进反应(6)～(9)的发生,另一方面抑制反应(10)～(11)的发生,减少钝化膜的产生,进一步提高Cr(VI)的去除效率.

5.2 Fe(II)/Fe(III)含量变化

在零价铁体系与Lysinibacillussp.JLT12-零价铁体系中，它们各自反应过程中Fe(II)和Fe(III)含量随时间变化的情况如图8所示.在零价铁体系中,随着反应的进行,Fe(II)和总Fe的含量一直增加,表明零价铁被腐蚀，发生还原反应;而Fe(III)的变化不太稳定,可能由于该过程伴随着Fe(III)的生成和形成Fe(OH)x沉淀.而在Lysinibacillussp.JLT12-零价铁体系中,由于微生物胞外聚合物的吸附以及Fe(OH)x的絮凝作用,溶液中Fe(II)和Fe(III)的含量较低.

5.3 Cr(VI)/Cr(III)含量变化

图9为还原过程Cr(VI)与Cr(III)含量变化情况.由图9(a)可知,在零价铁单独作用去除Cr(VI)的过程中，部分Cr(VI)转化为Cr(III),总铬含量几乎没有变化,而且转化速率逐渐减小并趋于稳定,在这一过程中零价铁对Cr的固定作用不明显.在微生物去除Cr(VI)过程中,由于固定或吸附等作用使总铬的含量减少,如图9(b)所示.而在Lysinibacillussp.JLT12-零价铁协同去除Cr(VI)过程中,不仅总铬含量减少,还有大量的Cr(VI)被转化为Cr(III),大大降低了毒性,见图9(c).对比可知,微生物对于零价铁还原Cr(VI)具有明显的促进作用,同时还可以实现Cr的固定.目前关于微生物提高零价铁还原Cr(VI)效率的报道较少,但物化法的研究结果表明,微生物提高零价铁还原能力的主要作用是促进零价铁的腐蚀,释放Fe(II)[3].

5.4 SEM-EDS分析

SEM分析表明：

在零价铁反应体系中,随着反应的进行,零价铁表面出现了腐蚀.在反应0 h和24 h时,零价铁表面的元素主要是Fe.反应48 h时零价铁表面检测到O元素,表明生成了FeO与Fe2O3等腐蚀产物.但是其表面始终未检测到Cr,说明并未有大量的Cr沉积到铁粉表面,零价铁对Cr无明显的吸附作用.

在Lysinibacillussp.JLT12反应体系中,Lysinibacillussp.JLT12主要是棒状杆菌.随着反应的进行,Lysinibacillussp.JLT12的形态并未发生明显改变,生长状况良好,未受Cr(VI)的毒害,能够适应污染环境.反应24 h、48 h和72 h时微生物表面的元素主要为Fe、O和S,并检测到大量Cr,表明微生物对Cr具有固定作用;研究表明该固定作用主要是来自微生物表面所分泌的胞外聚合物对Cr的吸附作用[18].

在Lysinibacillussp.JLT12-Fe体系中,随着反应的进行, 零价铁表面出现了腐蚀, 腐蚀程度比还原铁粉体系严重,微生物生长状况良好;在48 h和72 h,在体系表面检测到Cr,即有大量的Cr沉积到铁粉和微生物表面.协同作用一方面可以水解零价铁表面的钝化膜,促进零价铁腐蚀；另一方面有利于零价铁与Cr的接触，提高其还原固定Cr(VI)的能力.这与动力学分析结果一致.

图8 还原过程中Fe(II)与Fe(III)含量变化

图9 还原过程Cr(VI)与Cr(III)含量变化分析

零价铁加入含Cr(VI)溶液后,溶解产生的Fe(II)因扩散速度慢会累积在铁粉表面,消耗H+的同时使得溶液中的负离子(如OH-和CrO42-)迁移并富集于零价铁表面.随着反应的进行,溶液中铁粉表面附近的电解质浓度达到饱和,使以铁氧化物或铁铬氧化物的形式沉积在铁粉表面形成一层膜,即钝化膜[3].本研究中Lysinibacillussp.JLT12缓解零价铁钝化的机理有以下两点:一是产生H+,阻止铁铬氧化物的生成；二是相对于铁粉,微生物分泌的胞外聚合物更容易吸附铁铬氧化物,阻止了钝化膜沉积于零价铁表面.

6 结论

综上所述,在参加实验的菌种中,Lysinibacillussp.JLT12在好氧条件下可以显著提高零价铁对Cr(VI)的去除效率.实验中，当溶液中的葡萄糖浓度为8 g/L、酵母粉浓度为10 g/L、pH=7时,Lysinibacillussp.JLT12协同零价铁去除Cr(VI)的效果最好. 在Lysinibacillussp.JLT12添加前后, 零价铁对Cr(VI)的最大去除量由14.83 mg/g提高至18.49 mg/g.pH值分析表明Lysinibacillussp.JLT12是一株产酸菌,因此具有水解钝化膜的能力.SEM-EDS的分析结果表明,Lysinibacillussp.JLT12可以促进零价铁表面腐蚀,吸附固定Cr,阻止钝化膜的形成.而零价铁对Cr的固定能力较弱.考虑到含Cr(VI)废水中有机物含量可能比较少,后续拟添加为微生物提供营养的缓释营养盐.