MicroRNA-433在非小细胞肺癌A549细胞增殖及迁移中的作用

郑庆凯，张晓萍，邵润霞

（1.焦作市人民医院 呼吸内科，河南 焦作 454000；2.郑州大学第二附属医院呼吸内科， 河南 郑州 450014）

肺癌已成为人类癌症死亡的首要原因，其中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌总数的80%，由于临床缺乏早期有效诊断的生物学标志物，其5年生存率仍少于15%[1]。我国每年约有40 万人被确诊患有肺癌，且预计到2025年，人数将达到100 万人/年。因此，寻找能早期诊断的生物学标志物具有重要意义。

MicroRNA（miRNA）是一类长度约22 个核酸的非编码内源性小RNA，通过与目的基因的3'-非编码区（3'-UTR）相结合，调控靶基因的表达，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动[2]。研究表明，miRNAs 的异常表达与肺癌的发生、发展密切相 关，如miR-509-5p[3]、miR-512-5p[4]、miR-513[5]等。据报道，miR-433 在多种肿瘤中的表达下调，且发挥抑癌的作用，如口腔鳞状细胞癌[6]、结直肠癌[7]等，而其在肺癌中的表达及具体的作用机制尚未见报道，因此，本文旨在研究miR-433 对A549 细胞增殖及迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

NSCLC 细 胞 系A549、NCI-H1299、NCI-H358，人肺成纤维细胞系HFL1，HEK293 细胞等购自美国Abcam 公司；DMEM 培养基、10%胎牛血清、青霉素100 u/ml、链霉素100 mg/ml 购自美国Gibco 公司，miR-433 模拟物（miR-433 mimic）以及模拟物对照（mimic control）均由广州锐博生物科技有限公司合成，LipofectamineTM3000 购自Thermo Fisher Scientific，Trizol购自美国Invitorgen 公司，逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自日本TaKaRa 公司，MTT、RIPA 裂解购自美国Sigma 公司，Transwell 小室购自美国BD Biosciences 公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega 公司，兔抗人p21 活化激酶4 （p21-activated kinase 4,PAK4）、单丝氨酸蛋白激酶1（LIM domain kinase 1,LIMK1）、磷酸化单丝氨酸蛋白激酶1（phospho-LIM domain kinase 1,p-LIMK1）多克 隆抗体购自美国Abcam 公司，兔抗人丝切蛋白（Cofilin）和磷酸化丝切蛋白（p-cofilin）多克隆抗体购自美国CST 公司。

1.2 细胞培养

细胞均培养在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中进行培养。根据生长情况，每2 ～4 天传代1 次，取对数期的细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染

将A549细胞培养至80%融合时，按照LipofectamineTM3000 转染试剂说明书进行转染。分为空白对照组、miR-433 mimic（50、80 及100 nmol/L）组、mimic control 组。转染48 h 后，Real-time PCR 检测转染效率，选取最佳浓度进行后续实验。

1.4 real-time PCR 检测miR-433 水平

收集细胞，利用Trizol 法提取总RNA，然后按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，再按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书于ABI 7500 仪器（美国应用生物系统公司）进行real-time PCR，具体反应程序为：95℃ 预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40 个循环。目的基因表达量按照2-△△Ct法计算。

1.5 MTT 检测细胞活力

将处于对数生长期的A549 细胞以1×105个/ml 浓度接种于96 孔细胞培养板，于转染48 h 后加入5 μg/μl 的MTT 溶液20μl，孵育4 h 后每孔分别加入150 μl 的DMSO 溶液，最后于490 nm 波长处检测各组吸光度（Absorbance,A）值。

1.6 Transwell 检测细胞迁移能力

将A549 细胞调整为2×105个/ml，取200μl 加入到TranswellTM小室内，并进行转染。24 孔板中加入500 μl 含10%血清的DMEM 完全培养基，将TranswellTM小室放入24孔板中，继续培养48 h后取出。弃掉上室培养液，加入4%多聚甲醛固定10 min，经PBS 清洗后再用1%结晶紫染色3 min，PBS 清洗小室。最后于倒置显微镜下进行观察。随机选取5 个高倍镜视野，对穿过底膜的细胞进行计数。

1.7 荧光素酶活性实验检测miR-433 对PAK4 的靶向性

将包含PAK4 野生型（WT）的3'-UTR 的pmir GLO 质粒和PAK3 突变型（Mut）的3'-UTR 的pmir GLO 质粒分别与miR-433 mimic 和mimic control 转染至HEK293 细胞，每组各重复6 个孔，转染后48 h，利用双荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性，同时检测海肾荧光素酶活性作为内参对照。

1.8 Western blotting 检测蛋白水平

将处于对数生长期的A549 细胞以1×105个/ml 浓度接种于24 孔细胞培养板，转染48 h 后收集各组细胞，加入RIPA 裂解细胞，提取细胞总蛋白。取30 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳，然后转移至PVDF膜上，经5%脱脂牛奶封闭后，分别加入相应PAK4（1 ∶1 000 稀释）、LIMK1/p-LIMK1（1 ∶1 000 稀释）、cofilin/p-cofilin（1 ∶1 000 稀释）等一抗，4℃孵育过夜。然后加入辣根过氧化物酶偶联的抗兔（1 ∶2 000稀释）二抗，37℃孵育1 h。加入ECL 发光剂进行显色，曝光拍照。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用重复测量设计的方差分析或单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t检验。两组间差异比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-433 在NSCLC 细胞中的表达情况

miR-433 在多组间的表达，经单因素方差分析比较，差异有统计学意义（F=20.364，P=0.003）。miR-433 在NSCLC 细 胞 系A549（0.420±0.047）、NCI-H1299（0.510±0.082）、NCI-H358（0.480±0.032）中的表达与人肺成纤维细胞系HFL1（1.00±0.12）比较下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 过表达miR-433 对A549 细胞增殖的影响

过表达miR-433 后，不同浓度组间miR-433 表达，差异有统计学意义（F=26.321，P=0.004）。与空白对照组（1.00±0.12）比较，50、80 及100 nmol/L 的miR-433 mimic 表达量分别为（75.06±5.82）、（142.02± 10.25）、（106.89±8.57）可促进miR-433 的表达，其中，80 nmol/L 的miR-433 mimic 转染后，miR-433 表达量最高（P＜0.05）（见表1）。80 nmol/L 的miR-433 mimic 转染对A549 细胞增殖的影响，采用重复测量设计的方差分析，结果显示：①不同时间点的A549 细胞增殖率有差异（F=11.539，P=0.001）；②3 组间A549 细胞增殖率有差异（F=6.651，P=0.019），miR-433 mimic 组与mimic control 比较，细胞增殖能力较低，抑制细胞增殖效果较好；③miR-433 mimic 组与mimic control 组A549 细胞增殖率变化趋势有差异（F= 5.379，P=0.025）。见表1。

表1 80 nmol/L 的miR-433 mimic 转染对 A549 细胞增殖的影响 （±s）

表1 80 nmol/L 的miR-433 mimic 转染对 A549 细胞增殖的影响 （±s）

组别 24 h 48 h 72 h空白对照组 0.23±0.015 0.72±0.044 1.31±0.072 mimic control 组 0.21±0.023 0.68±0.055 1.28±0.123 miR-433 mimic 组 0.24±0.042 0.51±0.082 0.95±0.071

2.3 过表达miR-433 对A549 细胞迁移的影响

Transwell 结果显示，过表达miR-433 后，空白对照组A549 细胞迁移数为（89.25±7.71）个/视野，mimic control 组为（84.33±8.32）个/视野，miR-433 mimic 组为（31.76±4.66）个/视野，3 组间比较，差异有统计学意义（F=3.991，P=0.020）。与mimic control 组比较，miR-433 mimic 组A549 细胞迁移能力降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.4 miR-433 对PAK4 的靶向性

图1 miR-433 mimic 转染对A549 细胞迁移的影响

Target Scan Human 7.0 软件预测结果表明，PAK4为miR-433 的潜在靶基因。荧光素酶活性实验结果表明，在转染野生型PAK4 3'-UTR 的质粒时，与mimic control 组比较，miR-433 mimic 可抑制相对荧光素酶活性[（1.00±0.13）VS（0.42±0.09）（P=0.015）]，而在转染突变型PAK4 3'-UTR 的质粒时，miR-433 mimic 对相对荧光素酶活性无影响[（0.95±0.09） VS（0.91±0.07）] （见图2A）。此外，real-time PCR 和Western blotting结果显示PAK4在3种人NSCLC细胞系中的表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图2B 和表2）。

图2 miRNA-433 靶基因检测结果

表2 不同细胞中PAK4 mRNA 和蛋白的相对表达 （±s）

表2 不同细胞中PAK4 mRNA 和蛋白的相对表达 （±s）

注：†与HFL1 比较，P ＜0.05

组别 PAK4 mRNA PAK4 蛋白HFL1 1.00±0.12 1.00±0.08 A549 4.67±0.34† 3.25±0.21†NCI-H1299 4.86±0.42† 3.35±0.39†NCI-H358 5.01±0.68† 3.38±0.15†

2.5 过表达miR-433 对PAK4/LIMK1/Cofilin 信号通路的影响

由表3和图3可见，miR-433 mimic 转染后，3 组间PAK4、p-LIMK1 和p-Cofilin 的相对表达水平经单因素方差分析比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与mimic control 组比较，miR-433 mimic 转染后细胞中PAK4、p-LIMK1 以及p-Coflilin 的相对表达均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 miR-433 mimic 转染对PAK4/LIMK1/Cofilin 表达的影响 （±s）

表3 miR-433 mimic 转染对PAK4/LIMK1/Cofilin 表达的影响 （±s）

组别 PAK4 p-LIMK1 p-Coflilin空白对照组 1.00±0.03 1.00±0.04 1.00±0.07 mimic control 组 1.13±0.08 1.12±0.06 1.08±0.12 miR-433 mimic 组 0.46±0.05 0.34±0.08 0.16±0.08 F 值 5.165 8.491 18.365 P 值 0.015 0.009 0.000

图3 miR-433 mimic 转染对PAK4/LIMK1/Cofilin 信号通路的影响

3 讨论

研究报道，miR-433 编码的基因位于第12 号染色体，与多种肿瘤的发生、发展密切相关[8]。如miR-433 通过靶向调节Notch1 的表达，抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移[9]；miR-433 通过抑制环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的表达，抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭及迁移[10]。本研究结果表明，miR-433 在A549、NCI-H1299、NCI-H358 等NSCLC 细胞中的表达下降，且过表达miR-433 可抑制A549 细胞增殖及迁移。说明miR-433 可能在肺腺癌的发生、发展中发挥一定的抑癌作用。

PAK4 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的成员，是Rho-GTP 酶家族的下游效应器。PAK4 在各种细胞生命活动中具有重要的作用，其表达异常即可导致肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等[11]。已有研究报道，PAK4 在多种肿瘤中异常表达，如胃癌中的p-PAK4呈高表达，与胃癌不良预后相关[12]；高表达的PAK4 可通过激活PI3K/Akt 通路促进乳腺癌的发展[13]。此外，PAK4 在肺癌组织中呈异常高表达[14]，本研究结果同样显示，PAK4 在3 种NSCLC 细胞中的表达上升，且发现PAK4 为miR-433 的靶向调节基因，过表达miR-433 后PAK4 的表达降低。

LIMK1 是PAK4 下游的靶蛋白，通过调节Cofilin的磷酸化水平调节激动蛋白细胞骨架的重组，参与肿瘤血管形成、细胞侵袭和迁移[15]。研究表明，LIMK1/Cofilin信号通路在多种肿瘤的发生、发展过程中被激活，如鼻咽癌[16]。本结果同样表明，PAK4/LIMK1/Cofilin 信号通路在A549 细胞中被激活，而过表达miR-433 可抑制PAK4/LIMK1/Cofilin 信号通路。表明miR-433 对肺腺癌的抑制作用可能是通过抑制PAK4/LIMK1/Cofilin 信号通路实现。

综上所述，miR-433 可通过抑制PAK4/LIMK1/Cofilin 信号通路，抑制A549 细胞的增殖及迁移，为NSCLC 的治疗提供新的靶点及理论基础。