ERK/CT-1通路对氧化应激致H9C2细胞凋亡的影响

杜娜，戴红良，贾桂枝

（1.锦州医科大学附属第一医院 心血管内科二病区，辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学 护理学院，辽宁 锦州 121001；3.锦州医科大学 生理学教研室，辽宁 锦州 121001）

心肌营养因子-1（cardiotrophin-1,CT-1）属白细胞介素6 家族成员，最初从小鼠心脏胚胎干细胞中发现，在体外具有促进心肌细胞肥厚的生物活性[1]。研究显示心肌细胞在缺氧条件可诱导CT-1的过表达[2]。但目前对于CT-1 的功能及其表达上调的病理生理机制尚不明确。鉴于氧化应激在各种心血管疾病中所起的重要作用，本研究拟探讨在氧化应激情况下心肌细胞CT-1 的表达情况及其对心肌细胞凋亡的影响，以及氧化应激诱导CT-1 表达的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

H9C2 心肌细胞（中国科学院上海细胞库），胰蛋白酶、DMEM 培养基、过氧化氢、PD98059（美国Sigma 公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（美国 Gibco 公司），CT-1 抗体（美国Abcam 公司），Cleaved-Caspase-3、ERK、pERK 抗 体（美 国Cell Signaling 公 司），Annexin V-PI 凋亡试剂盒（北京宝赛生物有 限公司），CT-1 siRNA 干扰序列5'-CCAAUUGCUGGAGG AAUAUTT-3'（苏州吉玛基因股份有限公司）。二氧化碳培养箱、酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），倒置荧光显微镜（德国LEICA），流式细胞仪（美国BD公司），电泳仪及转膜仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 检测方法与指标

1.2.1 Western blotting 检测 根据研究目的，将细胞分为不同组别：为检测过氧化氢对H9C2 细胞CT-1表达及ERK 活化的影响，将细胞分为对照组及不同浓度（50、100、200 μmol/L）过氧化氢组；为检测抗氧化剂对H9C2 细胞CT-1 表达及Caspase-3 活化的影响，将细胞分为对照组、200 μmol/L 过氧化氢组、N- 乙酰半胱氨酸组、N-乙酰半胱氨酸+过氧化氢组；为检测CT-1 对过氧化氢诱导Caspase-3 活化的影响，将细胞分为对照组、200 μmol/L 过氧化氢组、CT-1 siRNA+过氧化氢组；为检测ERK 活化对CT-1 表达的影响，将细胞分为对照组、200 μmol/L 过氧化氢组、PD98059 组、PD98059+过氧化氢组。用细胞裂解液收集刺激完成细胞的总蛋白，离心收集上清后测定蛋白浓度，总蛋白行10%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。待电泳完成后电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用1% BSA 封闭1 h，接着加入待检测蛋白的一抗4℃孵育过夜。TBST 充分洗膜后，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育2 h。TBST 洗膜后，增强化学发光法（enhanced chemiluminescence,ECL）显色，以GAPDH 做为内参。

1.2.2 RNA 干扰 H9C2 细胞于转染前一天以无血清培养基培养24 h。预先将小干扰RNA（siRNA）与Opti-MEMI 按1 ∶16 混合；阳离子脂质体与Opti-MEMI 按照4 ∶11 混合。最后将上述2 个混合体系合并后与4 倍量的DMEM 一起加入到细胞中，在二氧化碳培养箱中继续培养8 h。最后，调整培养体系血清浓度为10%后继续培养72 h，用于后续研究。

1.2.3 流式细胞术检测凋亡细胞 为检测活性氧类（reactive oxygen species,ROS）及CT-1 对 过 氧 化氢诱导H9C2 细胞凋亡的影响，将细胞分为对照组、200 μmol/L 过氧化氢组、N-乙酰半胱氨酸+过氧化氢组及CT-1 siRNA+过氧化氢组。过氧化氢刺激24 h 后，各组细胞用0.25%胰酶消化2 ～3 min 后，以1 000 r/min 离心5 min 收集细胞，用预冷PBS 洗2 次，加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶各5 μl，避光室温反应15 min，于1 h 内利用流式细胞仪检测细胞凋亡 情况。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过氧化氢对H9C2 细胞CT-1 表达的影响

与对照组比较，不同浓度过氧化氢刺激H9C2 细胞24 h 后，Western blotting 检测结果显示CT-1 的表达随着过氧化氢浓度的增加而增加（见表1和图1），说明氧化应激刺激可增加H9C2 细胞CT-1 的表达。

表1 各组H9C2 细胞CT-1 表达水平比较 （±s）

表1 各组H9C2 细胞CT-1 表达水平比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与50 μmol/L 过氧化氢组比较，P ＜0.05；3）与100 μmol/L 过氧化氢组比较，P ＜0.05

组别 CT-1 相对表达水平对照组 1.000±0.000 50 μmol/L 过氧化氢组 1.230±0.087 100 μmol/L 过氧化氢组 1.603±0.1811）2）200 μmol/L 过氧化氢组 2.104±0.2261）2）3）F 值 30.655 P 值 0.000

图1 各组H9C2 细胞CT-1 的表达

2.2 N-乙酰半胱氨酸对H9C2 细胞CT-1 表达的影响

经200 μmol/L 过氧化氢刺激后，H9C2 细胞CT-1的表达明显增强，而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理可显著抑制过氧化氢诱导的CT-1 的表达（见表2和图2），表明过氧化氢诱导CT-1 的过表达是通过ROS 介导的。

表2 各组N-乙酰半胱氨酸对过氧化氢诱导的 CT-1 表达影响 （n =3，±s）

表2 各组N-乙酰半胱氨酸对过氧化氢诱导的 CT-1 表达影响 （n =3，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与200 μmol/L 过氧化氢组比较，P ＜0.05

组别 CT-1 相对表达水平对照组 1.000±0.000 200 μmol/L 过氧化氢组 2.155±0.2531）N-乙酰半胱氨酸组 1.033±0.125 N-乙酰半胱氨酸+过氧化氢组 1.117±0.1822）F 值 32.656 P 值 0.000

图2 N-乙酰半胱氨酸抑制过氧化氢诱导CT-1 的表达

2.3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 干扰对H9C2 细胞凋亡的影响

经200 μmol/L 过氧化氢刺激后，流式细胞仪检测显示H9C2 细胞的凋亡明显增加，而N-乙酰半胱氨酸预处理则明显抑制过氧化氢引起的细胞凋亡；相反，CT-1 敲低后H9C2 细胞的凋亡更加严重。见表3和图3。

表3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 对过氧化氢诱导 H9C2 细胞凋亡的影响 （±s）

表3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 对过氧化氢诱导 H9C2 细胞凋亡的影响 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与200 μmol/L 过氧化氢组 比较，P ＜0.05

组别 凋亡率/%对照组 5.841±1.145 200 μmol/L 过氧化氢组 22.174±3.1721）N-乙酰半胱氨酸+过氧化氢组 10.351±1.3392）CT-1 siRNA+过氧化氢组 27.297±2.1442）F 值 67.600 P 值 0.000

图3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 对过氧化氢 诱导H9C2 细胞凋亡的影响

2.4 N-乙酰半胱氨酸对过氧化氢诱导Caspase-3活化的影响

Active Caspase-3 的表达表明过氧化氢可通过对CT-1 的过表达负反馈性地抑制H9C2 细胞的凋亡。见表4、图4和表5、图5。

2.5 PD98059 对过氧化氢诱导的CT-1 表达的影响

与对照组比较，过氧化氢可浓度依赖性地促进H9C2 细胞ERK 的活化（见表6和图6），而丝裂原活化细胞外信号调节激酶（MEK/ERK）特异性抑制剂PD98059 可显著抑制过氧化氢诱导的CT-1 表达上调（见表7和图7）。

表4 N-乙酰半胱氨酸对过氧化氢诱导Caspase-3 活化的影响 （±s）

表4 N-乙酰半胱氨酸对过氧化氢诱导Caspase-3 活化的影响 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与200 μmol/L 过氧化氢组 比较，P ＜0.05

组别 Active Caspase-3 相对表达水平对照组 1.000±0.000 200 μmol/L 过氧化氢组 2.154±0.1941）N-乙酰半胱氨酸组 0.964±0.148 N-乙酰半胱氨酸+过氧化氢组 0.952±0.2082）F 值 40.721 P 值 0.000

图4 N-乙酰半胱氨酸对过氧化氢诱导 Caspase-3 活化的影响

表5 CT-1 siRNA 对过氧化氢诱导Caspase-3 活化的影响 （±s）

表5 CT-1 siRNA 对过氧化氢诱导Caspase-3 活化的影响 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与200 μmol/L 过氧化氢组比较，P ＜0.05

组别 Active Caspase-3 相对表达水平对照组 1.000 ± 0.000 200 μmol/L 过氧化氢组 1.846 ± 0.1571）CT-1 siRNA+过氧化氢组 2.591 ± 0.2432）F 值 68.059 P 值 0.000

图5 CT-1 siRNA 对过氧化氢诱导Caspase-3 活化的影响

3 讨论

成年心肌细胞属终端分化细胞，不具有再生增殖的能力。因此，心肌细胞的存活在维持心脏的功能和发育中起着极为关键的作用。当遇到各种伤害性刺激时，心肌细胞会通过自分泌或旁分泌等形式释放细胞保护因子，作为负反馈机制对抗各种损伤。

表6 过氧化氢对ERK 活化的影响 （±s）

表6 过氧化氢对ERK 活化的影响 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与50 μmol/L 过氧化氢组 比较，P ＜0.05

组别 pERK/ERK 相对水平对照组 1.000±0.000过氧化氢 50 μmol/L 组 1.646±0.2141）过氧化氢 100 μmol/L 组 1.982±0.2291）2）过氧化氢 200 μmol/L 组 1.818±0.1361）F 值 19.001 P 值 0.001

图6 过氧化氢对ERK 活化的影响

表7 PD98059 对过氧化氢诱导CT-1 表达的影响 （±s）

表7 PD98059 对过氧化氢诱导CT-1 表达的影响 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与200 μmol/L 过氧化氢组比较，P ＜0.05

组别 CT-1 相对表达水平对照组 1.000±0.000 200 μmol/L 过氧化氢组 2.042±0.1771）PD98059 组 1.067±0.125 PD98059+过氧化氢组 1.205±0.1652）F 值 37.923 P 值 0.000

图7 PD98059 对过氧化氢诱导CT-1 表达的影响

CT-1 在血清剥夺[3]、热休克[4]、缺血再灌注损伤等[5]损伤中呈现心肌保护的特性。体外研究显示[5]，在低氧状态下，心肌细胞CT-1 表达增加；体内研究也发现在不稳定性心绞痛[6]、急性心肌梗死[7]、高血压性心脏病等[8]病理状态下，外周循环中的CT-1 水平是增加的。但对于CT-1 在上述病理条件下如何升高，及其在疾病过程中发挥何种作用，目前尚不完全明确。

在缺血缺氧状态下，心肌组织会产生过量的ROS。这些ROS 攻击细胞的脂质、DNA 及蛋白质等生物大分子，并诱导心肌细胞发生凋亡[9-10]。本研究也发现，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可显著抑制过氧化氢诱导的H9C2 心肌细胞活化Caspase-3 的表达及凋亡。既然缺血缺氧可以诱导CT-1 的过表达，就有理由推测ROS 增加有可能是诱导CT-1 过表达的的重要机制。本研究发现，过氧化氢可剂量依赖性地诱导CT-1 的过表达。而且，利用特异性siRNA 敲低CT-1 后，无论是活化Caspase-3 的表达还是细胞的凋亡率均较过氧化氢组显著增加，表明上述病理状态下由ROS 激发的CT-1 过表达起到一种负反馈性保护机制，起到对抗氧化性损伤本身所带来的细胞损伤的作用。这与DONG 等[11]报道的CT-1 处理能促进心肌细胞活力的结论相一致。

本研究进一步对过氧化氢诱导CT-1 表达的机制进行初步探讨。有研究显示，过氧化氢预处理能通过激活ERK 保护心肌细胞对抗氧化应激引起的损伤和凋亡[12]。笔者推测过氧化氢诱导的CT-1 过表达有可能与ERK 的活化有关。本研究发现，MEK/ERK 特异性抑制剂PD98059 能显著抑制过氧化氢诱导的CT-1过表达。由此可见，ERK 不光可以作为下游分子介导CT-1 的各种生物学活性[13]，本研究也是首次发现ERK 可以作为上游分子介导CT-1 的过表达。对ERK如何能促进CT-1 的表达有待于进一步研究。

综上所述，本研究证实氧化应激在诱导心肌细胞发生凋亡性损伤的同时，可通过激活ERK 反馈性地诱导CT-1 的过表达，从而限制由氧化应激本身带来的心肌细胞损害。本研究不仅有助于进一步理解心血管疾病的病理生理机制，也可为疾病的防治提供新的线索。