Urantide 对动脉粥样硬化大鼠心脏UⅡ和GPCR14基因与蛋白表达的影响*

孙晓旭，王途，周健，刘凯，崔海鹏，谢云鹏，赵娟

（承德医学院，河北 承德 067000）

动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）时，动脉内膜脂质沉积形成粥样斑块，从而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死，出现心脏的病理改变。国内外大量研究报道，多种心脏疾病与AS 的发生、发展密切相关，互为因果[1-2]。因此，研究心脏的病理改变及发病机制，对防治AS 具有重要的临床意义。Urantide 是在人尾加压素Ⅱ（human urotensin Ⅱ,hU Ⅱ）基础上衍生而来，目前被认为是最有效的肽类U Ⅱ的特异性受体G 蛋白偶联受体14（G-proteincoupled receptors 14,GPCR14）的拮抗剂，U Ⅱ与其受体GPCR14 结合从而发挥生物学效应[3]。本课题组前期研究发现，Urantide 可加速胸主动脉壁内的胶原蛋白降解，抑制U Ⅱ对动脉炎症损伤的促进作用，改善AS 病变程度[3-4]。而Urantide 对AS 大鼠心脏的具体作用及机制尚不清楚。本研究利用大鼠AS 模型，探讨Urantide 对AS 大鼠心脏U Ⅱ、GPCR14 基因和蛋白表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及试剂 无特定病原体（SPF）级健康雄性Wistar 大鼠180 只，3 周龄，体重180 ～200 g， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）-2016-0011，生产合格证：11400700 127208]；Urantide 由苏州强耀生物公司提供，辛伐他汀（simvastatin）购自北京诺华制药有限公司，免疫组织化学（以下简称免疫组化）染色试剂盒（PV-6000）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液（P0013B）、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（P0006）和超敏电化学发光（ECL）试剂盒（Cat P0018）均购自上海碧云天生物技术有限公司，兔抗大鼠U II、GPCR14 均购自上海Santa 公司，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗购自美国Bioworlde 公司，Trizol（DP405-02）、TIAN Script cDNA 第一链合成试剂盒（KR104）、Super Real Pre Mix SYBR Green（FP204）均购自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 大鼠AS 模型复制及实验分组 高脂饲料配制：基础饲料，胆固醇35%，猪油10%，丙硫氧嘧啶0.2%，胆酸钠0.5%，白糖5%。Wistar 大鼠180 只随机分为2 组。正常组30 只，饲以普通饲料；模型组150 只，在实验开始时饲以高脂饲料，并在此基础上每只大鼠连续3 d 给予腹腔注射维生素D3150 u/（kg·d），实验周期为4 周[3-6]。AS 模型复制成功后，将150 只模型组大鼠又随机分为3 组：AS 模型组（AS 组）30 只，阳性药辛伐他汀组（辛伐他汀组）30 只，Urantide 3、7 和14 d 组90 只（给药时间分别为3、7 和14 d，每组30 只）。正常组和AS 组每只大鼠每日尾静脉注射生理盐水30 μg/kg，连续14 d；辛伐他汀组每只大鼠每日灌胃辛伐他汀5 μg/kg，连续14 d；Urantide 组每只大鼠每日尾静脉注射Urantide 30 μg/kg，给药时间分别为3、7 和14 d。

1.1.3 样本采集 各组大鼠均采用小动物麻醉机吸入式麻醉安乐死方法处理。胸主动脉样本采集：麻醉取血后，立即摘取胸主动脉，生理盐水洗去血迹后，4%多聚甲醛固定，大鼠胸主动脉经脱水、透明、浸蜡、包埋后制备成石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、常规HE 染色后，光学显微镜下拍照观察病理学变化。心脏样本采集：摘取胸主动脉后，立即摘取心脏，生理盐水洗去血迹后，一部分标本用4%多聚甲醛固定，待形态学检测；另一部分冷冻于液氮进行分子生物学检测。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化法检测大鼠心脏U Ⅱ和GPCR14 的表达 心脏经酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后，应用LEICA（上海徕卡显微系统有限公司，RM2255）切片机将组织切为3 ～4 μm 的蜡带，然后进行免疫组化染色。应用病理图形分析软件IP win32 对图像中阳性表达进行统计分析，计算各组大鼠心肌中U Ⅱ与GPCR14 阳性颗粒表达的光密度（OD）值。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测大鼠心脏U Ⅱ与GPCR14 mRNA 的表达 Trizol法提取心脏组织总RNA，紫外分光光度计进行定量检测，逆转录合成cDNA，qRT-PCR 检 测U Ⅱ、GPCR14、GAPDH mRNA 的Ct 值，引物序列见表1，扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火34 s，40 个循环；做熔解曲线。以各基因Ct 值与GAPDH mRNA Ct 值的差值为△Ct，采用2-△△Ct法计算各基因mRNA 的相对表达水平，并以正常组为参照做归一处理，其他各组与其做比较。

1.2.3 Western blotting 检测大鼠心脏U Ⅱ与GPCR14蛋白的表达 RIPA 裂解液提取组织样本的总蛋白，Bradford 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。45 μg蛋白于SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并转膜，封闭，U Ⅱ（1 ∶200）、GPCR14（1 ∶100）、GAPDH（1 ∶10 000）兔抗大鼠一抗4℃孵育过夜。加入HRP 标记山羊抗兔二抗（1 ∶5 000），37℃孵育1 h，洗膜后用超敏ECL 试剂盒显影。利用Image J 光密度分析软件对各蛋白目的条带灰度值与GAPDH 条带灰度值的比值作为各蛋白质的相对表达水平。

表1 引物序列

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS 大鼠胸主动脉的形态学改变

HE 染色结果显示，正常组大鼠胸主动脉内膜、中膜、外膜结构完整清楚，内皮细胞完整，中膜平滑肌细胞排列整齐，且外弹力板结构清晰，呈环形排列，外膜由疏松结缔组织构成；AS 组大鼠胸主动脉内皮细胞破坏，出现钙化及炎症细胞浸润，平滑肌细胞增殖、萎缩，弹力纤维破坏、变薄，内膜下脂质沉积形成AS 斑块，呈典型的AS 病理改变。表明，腹腔注射维生素D3及高脂饲料喂养的方法4 周后成功复制大鼠AS 模型。见图1。

2.2 免疫组化染色结果

各组大鼠心脏U Ⅱ与GPCR14 阳性表达经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。AS 组大鼠心脏U Ⅱ及GPCR14 阳性表达较正常组增多（P＜ 0.05），且多表达于血管周围及病变部位。与AS 组比较，经Urantide 治疗后Urantide 组大鼠心脏U Ⅱ及GPCR14 阳性表达减少（P＜0.05），其效果接近辛伐他汀组的表达水平（P＜0.05）。见图2、3 和表2。

2.3 各组大鼠心脏U Ⅱ及GPCR14 mRNA 表达

图1 AS 大鼠胸主动脉形态学改变 （HE×400）

图2 大鼠心脏U Ⅱ免疫组化染色结果 （×200）

图3 大鼠心脏GPCR14 免疫组化染色结果 （×200）

表2 各组大鼠心脏U Ⅱ和GPCR14 OD 值的比较 （n =30，±s）

表2 各组大鼠心脏U Ⅱ和GPCR14 OD 值的比较 （n =30，±s）

注：1）与AS 组比较，P ＜0.05；2）与辛伐他汀组比较，P ＜0.05

组别 U Ⅱ GPCR14正常组 0.16±0.041） 0.08±0.031）AS 组 1.66±0.15 1.20±0.06辛伐他汀组 0.69±0.131） 0.27±0.041）Urantide 3 d 组 0.80±0.041）2） 0.83±0.061）2）Urantide 7 d 组 0.58±0.071）2） 0.50±0.081）2）Urantide 14 d 组 0.61±0.071）2） 0.31±0.071）2）F 值 85.254 122.241 P 值 0.000 0.000

各组大鼠心脏U Ⅱ与GPCR14 mRNA 表达经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。AS组大鼠心脏U Ⅱ及GPCR14 mRNA 表达较正常组升高（P＜0.05）。与AS 组比较，经Urantide 治疗后各Urantide 组大鼠心脏U Ⅱ及GPCR14 mRNA 表达降低（P＜0.05），其效果接近辛伐他汀组的表达水平（P＜ 0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠心脏U Ⅱ及GPCR14 蛋白表达

各组大鼠心脏Ⅱ与GPCR14 蛋白表达经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。AS 组大鼠心脏U Ⅱ及GPCR14 蛋白表达较正常组升高（P＜ 0.05）。经Urantide 治 疗 后 各Urantide 组 大 鼠 心 脏U Ⅱ及GPCR14 蛋白表达降低（P＜0.05），其效果接近辛伐他汀组的表达水平（P＜0.05）。见表4和图4。

表3 各组大鼠心脏U Ⅱ和GPCR14 的mRNA 表达 （n =30，±s）

表3 各组大鼠心脏U Ⅱ和GPCR14 的mRNA 表达 （n =30，±s）

注：1）与AS 组比较，P ＜0.05；2）与辛伐他汀组比较，P ＜0.05

组别 U Ⅱ mRNA GPCR14 mR NA正常组 1.00±0.011） 1.00±0.081）AS 组 2.30±0.05 2.30±0.05辛伐他汀组 1.10±0.021） 1.20±0.041）Urantide 3 d 组 1.40±0.031）2） 1.32±0.061）2）Urantide 7 d 组 1.25±0.041）2） 1.48±0.071）2）Urantide 14 d 组 1.20±0.081）2） 1.10±0.091）2）F 值 67.125 64.100 P 值 0.000 0.000

表4 各组大鼠心脏U Ⅱ和GPCR14 的蛋白表达 （n =30，±s）

表4 各组大鼠心脏U Ⅱ和GPCR14 的蛋白表达 （n =30，±s）

注：1）与AS 组比较，P ＜0.05；2）与辛伐他汀组比较，P ＜0.05

组别 U Ⅱ蛋白 GPCR14 蛋白正常组 0.34±0.021） 0.50±0.011）AS 组 0.96±0.01 0.99±0.01辛伐他汀组 0.80±0.031） 0.05±0.001）Urantide 3 d 组 0.70±0.031）2） 0.19±0.001）2）Urantide 7 d 组 0.70±0.031）2） 1.45±0.001）2）Urantide 14 d 组 0.56±0.031）2） 0.13±0.001）2）F 值 89.031 93.428 P 值 0.000 0.000

图4 大鼠心脏U Ⅱ与GPCR14 的蛋白表达

3 讨论

U Ⅱ是一种生长抑素样环肽，最早从鱼的脊髓尾部下垂体中分离出来，是目前已知的最强的缩血管活性肽，U Ⅱ与其受体GPCR14 相结合构成U Ⅱ/UT 系统在生理和病理条件下发挥多种生物学功能[3]。国内外大量研究报道，U Ⅱ不但促进AS 的进展，而且参与了心肌纤维化、心脏重塑、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心力衰竭、心肌肥厚等多种心脏疾病的发生与发展，其有可能成为一个影响因素[7-8]。因此，以U Ⅱ为靶点，保护心脏、治疗AS 成为人们关注的热点。

Urantide 由hU Ⅱ衍生而来，目前被认为是最有效的U Ⅱ受体GPCR14 拮抗剂[3]。CERNARO 等[9]研究报道，Urantide 可以降低由U Ⅱ和转化生长因子β诱导的纤维连接蛋白的表达，在心肌纤维化中具有抗纤维化的作用。国内外有关Urantide 与动脉粥样硬化心脏的报道极少，迄今可查到的信息，基本上都来自本课题组所做的工作。本研究室前期研究证明，在体内实验中，U Ⅱ及其受体GPCR14 基因与蛋白在AS大鼠胸主动脉中大量表达，且U Ⅱ可促进炎症因子的释放，而Urantide 可以下调其表达量，减轻胸主动脉的炎症损伤，起到保护胸主动脉的作用；在体外实验中，U Ⅱ可以促进血管平滑肌细胞的增殖，上调血管平滑肌细胞中U Ⅱ与其受体GPCR14 基因与蛋白的表达水平，促进炎症因子的释放，Urantide 则可以下调其表达量，对血管平滑肌细胞中的炎症因子具有抑制调作用，从而改善AS 病理改变[10]。

本结果显示，Urantide 作为U Ⅱ受体GPCR14 的拮抗剂，可减少大鼠心脏U Ⅱ、GPCR14 的阳性颗粒表达；qRT-PCR 及Western blotting 结果进一步证实Urantide 对AS 大 鼠 心 脏U Ⅱ、GPCR14 mRNA 及 蛋白质表达水平均具有下调作用。笔者推测，U Ⅱ与其受体GPCR14 结合后可加重AS 大鼠的心脏损伤，而Urantide 则可阻断U Ⅱ这种促进作用，减轻大鼠AS病理改变。

综上所述，Urantide 可以通过降低AS 大鼠心脏U Ⅱ及其受体GPCR14 的基因及蛋白质的表达水平，而起到对抗损伤、保护心脏，治疗AS 的作用。但有关于Urantide 对AS 大鼠心脏的具体作用机制，还需进一步研究，以期为临床应用Urantide 治疗AS 提供更多的实验依据。