丙泊酚联合卡铂对乳腺癌细胞凋亡及JAK/STAT通路的影响

张新科，司小萌，张朔

（南阳市中心医院 麻醉科，河南 南阳 473000）

乳腺癌严重威胁妇女身体健康，为临床常见妇科肿瘤。调查显示近年来其发病率逐年升高，在所有妇科恶性肿瘤中占据首位，因此，探究乳腺癌发生、发展的确切机制对疾病的靶向治疗至关重要[1]。临床治疗乳腺癌主要以手术结合铂类化疗为主，卡铂为二代铂类药物，在乳腺癌治疗中应用较广，但容易产生耐药性，患者生存率并未得到明显改善，因此，如何降低药物的耐药性是目前治疗乳腺癌的重要途径[2]。丙泊酚为临床常用静脉麻醉药物，在乳腺癌等多种肿瘤切除手术中应用广泛，近期研究显示其能够抑制卵巢癌、肝癌、前列腺癌等癌细胞的侵袭、迁移进而抑制肿瘤的增殖[3]。王萍等[4]研究显示，丙泊酚对耐药性癌细胞具有抑制作用，同时不作用于敏感肿瘤细胞，与化疗药物结合后能够抑制肿瘤细胞产生耐药性，然而在乳腺癌中是否也有相同作用，目前尚未见报道。本研究通过体外培养乳腺癌细胞并给予丙泊酚联合卡铂处理，以探究其对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响，以及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7 购自中国科学院上海细胞研究所，置入-80℃冰箱冷冻保存，使用时取出，放置37℃解冻，置于RPMI 1640 培养液，置于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱内培养，当细胞生长至80%时，加入0.25%胰酶溶液进行消化，进行传代培养，当细胞培养至第3 代时，可用于后续研究。

1.2 仪器与试剂

丙泊酚购自美国Sigma 公司，卡铂购自上海赛默飞公司，胎牛血清以及含青霉素、链霉素RPMI 1640培养基购自美国Gibco 公司，胰酶溶液购自上海碧云天生物研究所，鼠抗人p-JAK2、p-STAT3、β-actin抗体购自美国Santa Cruz 公司，Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 二抗购自美国R＆D 公司，PDVF 膜购自生工生物工程（上海）有限公司，二联喹啉酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白检测试剂盒购自美国Thermo 公司，电子荧光显微镜购自日本Olympus 公司，蛋白凝胶成像仪购自Bio-Red 公司。

1.3 细胞分组

取对数期MCF-7 细胞接种于96 孔板中，细胞密度调整为1×104个/ml，培养24 h 将细胞分为4 组：对照组、丙泊酚组（100 μmol 丙泊酚组）[5]、卡铂组（20 μmol/L 卡铂组）[6]、联合组（100 μmol 丙泊酚+ 20 μmol/L 卡铂组）。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 CCK-8 法检测细胞增殖 各组细胞处理后置于37℃、5% CO2潮湿培养箱内，每组设置6 个重复，以不接种细胞的培养液作为空白孔，分别培养24、48、72 和96 h，结束后添加CCK-8 试剂孵育4 h，离心后保留下层细胞添加DMSO 避光孵育15 min，置于酶标仪570 nm 处检测光密度（OD）值，细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD 值/对照组OD 值）× 100%。

1.4.2 细胞形态学观察 细胞分组后继续培养12 h，接种在含盖玻片6 孔板内，过夜孵育更换新鲜培养液继续培养24 h，弃去上层培养液，PBS 漂洗后添加10%甲醛固定1 h，PBS 清洗后，添加Hoechst33342 染液染色20 min，冲洗后置于荧光显微镜下观察细胞形态 变化。

1.4.3 细胞菌落形成检测 取对数期细胞，密度调整为300 个/ml，于培养皿（直径60 mm）孵育24 h 后，进行上述不同处理后，于37℃下培养2 周，将菌落用固定剂（甲硫醇∶冰醋酸=7 ∶1）固定15 min 后，用含结晶紫20%甲醇染液对菌落染色30 min，清洗晾干后拍照计数菌落形成个数。

1.4.4 PI/Annexin V-FITC 双染法检测细胞凋亡 收集各组细胞添加0.2%胰酶溶液消化，细胞密度调整为1×106个/ml，采用预冷PBS 清洗后，加入150 μl结合缓冲液重悬，随后添加5 μl PI、10 μl Annexin V-FITC，置于4℃冰箱中避光条件下孵育30 min，置于流式细胞仪中检测对细胞凋亡情况。

1.4.5 Western blotting 检测蛋白表达 采用裂解缓冲液裂解细胞，冰上孵育30 min 后，离心取上清液，使用蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白。采用10% SDS-PAGE 凝胶上分离，并转移至PDVF 膜上，加入BSA 室温下封闭后，添加一抗稀释液（1 ∶500）在室温下孵育1 h。PBS 清洗后，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG 二抗稀释液（1 ∶5 000）室温下与膜孵育1 h，通过ECL 化学发光液进行发光显影，采用Image J 软件分析蛋白相对表达。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖情况

随着培养时间的增加，各组细胞的抑制率逐渐升高。同一时间点，丙泊酚组、卡铂组细胞抑制率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），丙泊酚组、卡铂组均升高；联合组细胞抑制率与丙泊酚组、卡铂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组均升高。见表1。

表1 各组MCF-7 细胞抑制率比较 （%，±s）

表1 各组MCF-7 细胞抑制率比较 （%，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与丙泊酚组、卡铂组比较，P ＜0.05

组别 24 h 48 h 72 h 96 h对照组 4.09±0.32 6.13±0.25 9.19±0.34 13.21±0.68丙泊酚组 10.18±1.531） 12.22±2.091） 14.29±2.191） 18.32±2.161）卡铂组 11.19±1.761） 13.24±3.141） 15.13±3.241） 19.16±2.851）联合组 21.45±2.752） 26.53±3.372） 30.72±2.682） 34.71±3.482）F 值 94.963 69.110 91.939 81.614 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 细胞形态学变化

Hoechst 染色显示，对照组细胞形态、大小均正常，丙泊酚组、卡铂组细胞体积明显变小，细胞核荧光强度增大，部分出现碎片化，联合组细胞核固缩现象更加明显。见图1。

2.3 细胞克隆形成情况

丙泊酚组、卡铂组细胞菌落数量与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），丙泊酚组、卡铂组均降低；联合组细胞菌落数量与丙泊酚组、卡铂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组降低。见表2和图2。

图1 细胞染色结果 （Hoechst 染色 ×100）

2.4 细胞凋亡情况

丙泊酚组、卡铂组细胞凋亡率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），丙泊酚组、卡铂组均升高；联合组细胞凋亡率与丙泊酚组、卡铂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组升高。见表3和图3。

表2 细胞菌落数量比较 （个，±s）

表2 细胞菌落数量比较 （个，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与丙泊酚组、卡铂组比较，P ＜0.05

组别 菌落数量对照组 74.37±11.69丙泊酚组 59.86±12.561）卡铂组 60.36±9.271）联合组 23.49±4.682）F 值 82.963 P 值 0.000

图2 细胞菌落形成情况

表3 各组细胞凋亡率比较 （%，±s）

表3 各组细胞凋亡率比较 （%，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与丙泊酚组、卡铂组比较，P ＜0.05

组别 凋亡率对照组 0.28±0.03丙泊酚组 4.75±0.561）卡铂组 4.83±0.781）联合组 16.27±4.222）F 值 61.852 P 值 0.000

图3 细胞凋亡情况

2.5 不同细胞系中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达

MCF-7 细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达与正常乳腺上皮细胞MCF-10A 比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05），MCF-7 细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达均升高。见表4和图4。

2.6 各 组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达

丙泊酚组、卡铂组Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），丙泊酚组、卡铂组Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达与均升高，丙泊酚组、卡铂组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），丙泊酚组和卡铂组均降低。见表5和图5。

表4 各细胞系p-JAK2、p-STAT3蛋白表达比较 （±s）

表4 各细胞系p-JAK2、p-STAT3蛋白表达比较 （±s）

注：†与MCF-10A 细胞系比较，P ＜0.05

细胞系 p-JAK2 p-STAT3 MCF-10A 0.14±0.03 0.21±0.04 MCF-7 0.87±0.11† 0.83±0.13†t 值 15.158 13.371 P 值 0.000 0.000

图4 MCF-10A、MCF-7 细胞中p-JAK2、 p-STAT3 蛋白表达

表5 各组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达比较 （±s）

表5 各组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达比较 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与丙泊酚组、卡铂组比较，P ＜0.05

组别 p-JAK2 p-STAT3 Bax Bcl-2 Cleaved Caspase-3对照组 1.09±0.14 1.01±0.14 0.18±0.04 1.05±0.17 0.16±0.04丙泊酚组 0.68±0.051） 0.49±0.061） 0.65±0.081） 0.56±0.041） 0.52±0.061）卡铂组 0.66±0.091） 0.51±0.071） 0.69±0.061） 0.55±0.081） 0.55±0.041）联合组 0.32±0.042） 0.23±0.082） 1.17±0.132） 0.17±0.092） 1.08±0.092）F 值 53.446 71.293 41.545 60.440 51.791 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图5 各组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达情况

3 讨论

铂类药物在临床肿瘤治疗中应用较广泛，其能够通过与肿瘤细胞DNA 发生交联，进而影响细胞的复制、转录，抑制细胞的增殖，引发细胞死亡。研究显示卡铂单药对乳腺癌的总缓解率可达50%，体外研究显示，采用不同浓度卡铂处理乳腺癌细胞，细胞的抑制率升高，且细胞凋亡率也随之升高，提示卡铂能够阻碍乳腺癌细胞体外增殖，并且可以诱导其凋亡[7]。丙泊酚为临床常用静脉麻醉药物，具有起效快、苏醒快、安全性高等优点。近期研究显示丙泊酚能具有抗肿瘤的作用，在肺癌中研究显示，丙泊酚通过阻断金属基质蛋白酶表达进而抑制肿瘤细胞的侵袭、转移，抑制肺癌细胞的增殖[8]。有结肠癌研究[9]显示，丙泊酚能够通过抑制ERK 信号通路活性，进而抑制肿瘤细胞的侵袭、转移。以上结果均显示丙泊酚具有抑制肿瘤增殖的作用。卡铂在治疗肿瘤时，近期疗效较好，但易产生耐药性，据报道，丙泊酚能够抑制耐药性肿瘤细胞，同时对敏感性细胞无影响[4]。基于以往研究推测，丙泊酚联合卡铂可能会增强卡铂抗肿瘤效果，本研究结果显示，丙泊酚与卡铂两者联合后细胞抑制率升高，提示两者结合后，共同抑制乳腺癌细胞的增殖。但具体作用机制尚不明确。

一般情况下，细胞凋亡多出现于衰老、病变细胞，因此清除衰老、病变细胞，对维持机体健康状态十分重要；当受到外界刺激或内部刺激时，细胞其生长和凋亡相关的基因发生失调，导致凋亡程序紊乱，引起细胞异常凋亡，进而引发病理性损伤[10]。研究显示丙泊酚能够通过影响上调miR-let7i 进而诱导上皮性卵巢癌细胞的凋亡[11]。体外研究显示卡铂处理后能够明显抑制人肺腺癌、宫颈癌细胞的增殖，且诱导其凋亡[12]。以上研究均提示丙泊酚、卡铂均能诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。本研究结果显示丙泊酚组、卡铂组细胞体积明显变小，细胞核荧光强度增大，部分出现碎片化，且流式细胞仪检测显示联合组细胞凋亡率较单独用药组升高，提示经联合处理后肿瘤细胞凋亡更为明显。

细胞凋亡是机体内调节细胞自主死亡的生物过程，其发生的涉及凋亡诱导因子和凋亡抑制因子等调节因子[13]。Bcl-2 家族包括多种与细胞凋亡密切相关的蛋白成员，包括抑凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bcl-2 相关X 蛋白Bax 等成员[14]。一般情况下，细胞线粒体中Bcl-XL、Bcl-2 通过结合Bax 形成二聚体抑制细胞调亡；受到外界损伤后，Bax 蛋白表达升高，导致二聚体增多并聚集在线粒体膜，使线粒体膜通透性升高，促使AIF 等凋亡因子进入细胞质，激活Caspase级联反应进而诱导细胞凋亡[15-16]。本研究结果显示，联合组，Cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表达均升高，Bcl-2 蛋白表达均降低，与丙泊酚组、卡铂组有差异，提示经丙泊酚、卡铂处理后肿瘤细胞出现一定凋亡，联合处理后细胞凋亡更为明显，进一步说明两者联合使用可进一步抑制肿瘤增殖。

酸激酶JAK/转录因子STAT 信号（JAK/STAT）信号通路在多类细胞生长、分化、凋亡以及炎症反应发生中发挥重要作用。细胞因子与受体结合后形成二聚体且与JAK 靠近，进而被酪氨酸残基磷酸化，吸引转录因子STAT 与受体结合，使STAT 磷酸化进而与受体解离形成二聚体，逐渐转移至细胞核内参与下游靶基因的调控，因而JAK 的磷酸化后能够激活STAT磷酸化，进而引发下游抗肿瘤凋亡因子表达失调，引发肿瘤，因此JAK/STAT 信号通路可能为治疗癌症的靶点[17]。滕文静等[18]研究显示，重楼皂苷抑制JAK/STAT3 信号通路活化进而诱导结直肠癌细胞凋亡。杨慧梅等[19]研究显示，在添加JAK/STAT 信号通路抑制剂后能够促进脑胶质瘤细胞凋亡。以上研究均提示抑制JAK/STAT 信号通路能够促进癌细胞凋亡。本研究显示，与对照组比较，丙泊酚组、卡铂组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2 蛋白表达均降低，联合组p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2 蛋白表达进一步降低，提示丙泊酚联合卡铂可能通过抑制JAK/STAT 信号通路活化，进而诱导乳腺癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。

综上所述，丙泊酚联合卡铂可能通过抑制JAK/STAT 信号通路活化，上调凋亡蛋白的表达，诱导其凋亡，从而抑制乳腺癌生长，发挥抗肿瘤作用，这可能为乳腺癌细胞治疗的靶点，然而本研究仅以乳腺癌细胞系MCF-7 作为研究对象，所涉及相关信号通路还有待深入探究。