槐耳清膏能抑制裸鼠肺癌细胞的增殖活性

童 琳， 常美佳， 胡 洁， 周 建， 白春学

复旦大学附属中山医院呼吸科，上海市呼吸病研究所，上海 200032

近年来，随着对肺癌发病机制研究的进一步深入，新兴的治疗手段不断涌现，使得晚期肺癌患者的预后得到较大改善。然而，老年晚期肺癌患者常无法耐受放化疗、靶向等治疗引起的不良反应。因此，应用不良反应小而有良好免疫增强和抗肿瘤作用的药物是晚期肺癌治疗的理想手段。

槐耳是生长在中国古槐树上的一种天然菌，1 500余年前已作为药物治疗多种疾病。槐耳清膏是槐耳菌质的提取物，具有诱导肿瘤细胞分化和凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性、提高免疫细胞杀伤能力、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力等多靶位抗肿瘤功效[1]。体外研究[2]发现，槐耳清膏能诱导人肺腺癌细胞凋亡，逆转肺腺癌细胞对顺铂的耐药性，增强顺铂的化疗作用。本研究通过探讨槐耳清膏对裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤作用，分析其对肺癌的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材 料 槐耳清膏制剂由启东盖天力药业有限公司提供。将槐耳清膏溶于0.9% NaCl溶液，分别制成100、300、500、700 mg/mL的含药溶液，用于槐耳清膏组裸鼠灌胃。SPF级裸鼠由复旦大学附属中山医院中心实验室提供，雄性25只，鼠龄4～6周。

1.2 动物实验 将PC9R肺癌细胞等量(1×107)接种到25只裸鼠皮下，待接种14 d接种部位肿瘤长出后，将其随机分为5组，每组5只(实验过程中有裸鼠死亡情况，因此实验终点取瘤体时每组裸鼠为4～5只)。第1组每3 d给予槐耳清膏1 g/kg；第2组每3 d给予槐耳清膏3 g/kg；第3组每3 d给予槐耳清膏5 g/kg；第4组每3 d给予槐耳清膏7 g/kg；对照组每3 d给予0.9% NaCl溶液0.2 mL。接种前、接种14 d后以及给药期间每周称裸鼠体质量。喂养3周后颈椎脱臼处死，完整取出瘤体，比较各组瘤重和瘤体积，计算抑瘤率。抑瘤率的计算方法如下：用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)和最短径(b)，肿瘤体积V=ab2/2；肿瘤相对体积(RTV)=某时间点肿瘤体积/分组时肿瘤体积；抑瘤率=(1-RTV槐耳清膏组/RTV对照组)×100%。

1.3 组织病理学检查 肿瘤组织进行常规石蜡包埋切片，切片厚5 μm，进行常规苏木精-伊红(H-E)染色，显微镜下观察肿瘤组织的病理学改变。肿瘤组织经Ki-67(DAKO公司提供)免疫组化染色，计算肿瘤组织Ki-67阳性细胞比率。

2 结 果

2.1 槐耳清膏对裸鼠皮下接种肺癌细胞成瘤的影响 25只裸鼠在接种PC9R肺癌细胞14 d后，接种部位均长出肿瘤，其他部位和器官均未见肿瘤生长。对肿瘤生长的抑制作用以槐耳清膏5 g/ kg和7 g/kg剂量组的作用较强，槐耳清膏3 g/kg组和1 g/kg组较弱。其中，5 g/kg体质量(P=0.004 4)和7 g/kg剂量组(P=0.021 5)抑瘤率与对照组差异有统计学意义(表1)；槐耳清膏7 g/kg组与5 g/kg组抑瘤率差异无统计学意义。喂养3周后取出移植瘤，称重，显示槐耳清膏5 g/kg组瘤重较对照组降低，但差异无统计学意义(图1)。

表1 槐耳清膏对裸鼠肺癌的抑瘤率

**P<0.01，*P<0.05与对照组相比

图1 槐耳清膏对裸鼠肺癌移植瘤质量的影响

2.2 槐耳清膏对皮下接种肺癌裸鼠体质量的影响 分别于种瘤前、种瘤后14 d、喂养期间每周称裸鼠体质量，结果(图2)显示：对照组裸鼠体质量在喂养前2周逐步增长，在喂养第3周较前有所减轻；槐耳清膏3 g/kg、5 g/kg和7 g/kg组裸鼠体质量在喂养第3周仍呈增长趋势，但差异无统计学意义。

图2 槐耳清膏对肺癌移植瘤裸鼠体质量的影响

1：种瘤前；2：种瘤后14 d；3：给药1周后；4：给药2周后；5：给药3周后

2.3 槐耳清膏对裸鼠皮下接种肺癌细胞的组织病理学影响 H-E染色结果(图3)显示：对照组肿瘤细胞生长旺盛，有异型性，形态不规则，大小不等，细胞核大、浓染，可见病理性核分裂相，无明显坏死区。槐耳清膏组肿瘤细胞出现不同程度退行性变，局部出现缺血坏死区，坏死灶周围可见残存肿瘤细胞。

图3 槐耳清膏对裸鼠肺癌肿瘤组织病理的影响(H-E染色)

A：对照组；B：槐耳清膏5 g/kg组. Original magnification: ×200

2.4 槐耳清膏对裸鼠皮下接种肺癌细胞的增殖指数影响 对肺癌移植瘤组织进行Ki-67免疫组化染色，结果(图4)显示：槐耳清膏3、5、7 g/kg组肿瘤细胞Ki-67阳性率均较对照组下降，其中7 g/kg组Ki-67阳性率最低(24.8%，P<0.001)，提示槐耳清膏对肿瘤细胞增殖活性有明显抑制作用。

图4 槐耳清膏对裸鼠肺癌肿瘤细胞Ki-67阳性率的影响

1：对照组；2：槐耳清膏1 g/kg；3：槐耳清膏3 g/kg；4：槐耳清膏5 g/kg；5：槐耳清膏7 g/kg. Original magnification: ×200.**P<0.01，*P<0.05与对照组相比

3 讨 论

肺癌已成为全球癌症相关死亡的首要病因，其死亡率占恶性肿瘤死亡率的第1位。目前肺癌的治疗采用以外科手术为主的综合疗法，但有一半以上的肺癌患者确诊时已是晚期，失去手术机会，可供选择的方案为化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等的综合治疗，但总体预后仍欠佳，并且治疗的不良反应较大，较多患者无法耐受。因此，寻找对肺癌治疗有效而人体不良反应小的药物，一直是肺癌治疗的研究热点。槐耳清膏是槐耳菌质经热水提取物，含有多种有机成分，10余种矿物质元素。槐耳多糖蛋白是槐耳清膏的主要活性成分，由6个单糖结合18种氨基酸组成，是一种活性很高的生物反应调节剂。槐耳清膏具有诱导肿瘤细胞分化和凋亡，提高免疫细胞杀伤能力，抑制肿瘤细胞迁移、侵袭能力等多重抗肿瘤功效[1]。槐耳清膏对正常细胞几乎没有损害。目前槐耳清膏已被制成槐耳颗粒应用于临床，对肺癌、结肠癌、肝癌、食管癌等肿瘤都有明显疗效[1]。小样本的临床研究[3-5]发现，槐耳能延长晚期肺癌患者的生存期，改善其生活质量和免疫功能。

既往研究[6]显示，槐耳对体外培养的人大细胞肺癌L9981具有剂量依赖性的生长抑制作用，其机制可能与调控血管生成相关基因表达有关。槐耳处理后的肺癌A549细胞miRNA基因芯片检测结果显示，有66个miRNA异常表达，其中miR-26b-5p上调可抑制肺癌细胞A549增殖，诱导其凋亡，而特异性的抑制剂可逆转槐耳的作用。进一步机制研究发现，槐耳可能通过调控miR-26b-5p的作用靶点EZH2起到抗肿瘤作用；EZH2可上调wnt/β-catenin信号通路，进而上调β-catenin的表达，而β-catenin能够上调Bcl-2的表达[7-9]。此外，槐耳多糖蛋白对非小细胞肺癌患者Th1/Th2细胞的免疫反应状态具有调节作用[10]。

槐耳对肺癌的治疗作用研究目前主要集中在体外细胞实验，尚无动物体内研究进一步证实其疗效。本研究通过建立裸鼠肺癌移植瘤模型，观察槐耳清膏对肺癌细胞体内成瘤的影响，发现槐耳清膏对裸鼠移植瘤肺癌细胞具有显著的抑瘤作用，其中5 g/kg和7 g/kg剂量下抑瘤率较高。Ki-67染色显示，槐耳清膏组肿瘤细胞增殖活性明显降低，提示槐耳对肺癌细胞的增殖具有抑制作用。此外，与对照组相比，槐耳清膏组裸鼠体质量逐步增长，提示槐耳对裸鼠的进食消化吸收等胃肠道功能无明显影响，其抑制肿瘤生长的作用可逆转肿瘤生长引起的裸鼠体质量减小。槐耳清膏具有不良反应少、耐药性低、费用较其他治疗手段少的特点，为肺癌治疗的研究提供了新方向，但其具体作用机制有待进一步研究[11]。

本文全体作者声明：本研究由国家自然科学基金(81490533, 81400018, 81570028, 81770039)，复旦大学附属中山医院临床研究专项基金(2016ZSLC05)，北京医卫健康公益基金会医学科学研究基金(F2037E-中山医院)支持，不受任何其他第3方的资金赞助，本研究结果无任何相关利益冲突。