长链非编码RNA-linc00152可能通过miR-4767影响血管内皮细胞凋亡和迁移

滕 伟， 郑先杰， 巩贵宏， 何兆辉， 张君毅， 惠学志

河南大学第一附属医院心内科，开封 475001

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可根据其在基因组中的位置分为正义lncRNA(sense lncRNA)、反义lncRNA(antisense lncRNA)、双向lncRNA(bidirectinal lncRNA)、基因内lncRNA(intronic lncRNA)和基因间lncRNA(intergenic lncRNA，又称lincRNA)5种类型。其中，linc00152在肝细胞肝癌细胞中起转录因子的作用[1]。而在胃癌细胞中，linc00152可起到信号传导或支架作用。 RNA降低和RNA免疫沉淀实验[2]显示，linc00152可直接与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)结合并激活PI3K/Akt信号传导。

miR-4767最早被发现于乳腺癌[3]。最近一项研究[4]证实Bcl2L12和EGFR都是miR-4767的靶基因，并证实miR-4767通过靶向抗凋亡基因Bcl2L12参与人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的凋亡过程。然而，miR-4767在HUVEC迁移中的作用机制尚不明确。

因此，本研究通过过表达或阻断linc00152及miR-4767，检测linc00152对经氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理的HUVEC凋亡、迁移的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和ox-LDL处理 HUVEC购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，HEK293T细胞购自上海生命科学研究院细胞资源中心。将HUVEC置于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和 100 mg/mL链霉素的DMEM中，在37℃、5% CO2培养箱中培育。将HUVEC以105个/孔接种于12孔培养板中传代培养，当细胞汇合度达50%时，将ox-LDL[溶于含有 0.08 μmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)的磷酸盐缓冲液(PBS)]以50、100、150、200 μg/mL分别加入细胞中，分别标记培养24 h。对照组用含0.08 μmol/L EDTA-Na2的等体积PBS培养细胞24 h。

1.2 载体转染 用阳离子脂质体lipofectamine 3000(Invitrogen公司)分别转染含或不含全长linc00152序列的pcDNA3.1、linc00152 siRNA(silinc00152)、miR-4767模拟物、miR-4767拮抗剂及混杂的阴性对照寡核苷酸。

1.3 实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(qRT-PCR) 采用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)提取细胞的总RNA，用反转录酶SuperScript Ⅲ试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]以25 μL的终体积进行qRT-PCR，并通过iQ5TM多色实时PCR检测系统(Bio-Rad公司)监测反应过程。反应条件如下：95℃ 1 min；94℃ 15 s、54℃ 30 s、72℃ 20 s，共35个循环。应用2-ΔΔCt方法计算所有测试基因的转录浓度(以U6作为内参)。反应中使用的引物由广州锐博生物科技有限公司设计和合成。

1.4 蛋白质印迹 将蛋白样品定量后，计算出含30 μg蛋白质的样品量，用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目标蛋白质并转移至0.22 μm PVDF膜(Millipore公司)。转膜后，用以下抗体4℃孵育过夜：抗-Bcl2L12(1∶500，Abcam公司)，EGFR抗体(1∶500，Abcam公司)，抗-PI3K(1∶400，CST公司)，抗-p-PI3K(1∶200，CST公司)，抗半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶7(抗Caspase -7，1∶300，Abcam公司)，抗β-肌动蛋白(1∶800，Abcam公司)。 用相应的辣根过氧化物酶标记法孵育后，用增强型化学发光(ECL)蛋白质印迹试剂盒(Millipore公司)及凝胶成像系统(Bio-Rad公司)分析。

1.5 linc00152与HUVEC的荧光原位杂交 采用FISH试剂盒(Roche公司)检测linc00152的亚细胞定位。收集HUVEC，洗涤2次，并用4%多聚甲醛固定，加入杂交溶液及地高辛标记的linc00152探针；探针作为阴性对照。细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)室温染色10 min。用冷PBS重复冲洗2次后，在共聚焦激光扫描显微镜(FV 1000，Olympus公司)下观察。

1.6 HUVEC凋亡和迁移检测 重组载体转染HUVEC 48 h后，用ox-LDL处理HUVEC，检测HUVEC的凋亡与迁移情况。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)试剂盒(Roche公司)，通过计算杂交后12个培养孔中共计1 000个细胞的阳性细胞数来定量各转染组凋亡情况。采用Transwell迁移实验检测细胞迁移情况。

1.7 荧光素酶报道重组子构建和活性检测 分别采用野生型(WT)Bcl2L12 3’UTR、EGFR 3’UTR扩增linc00152序列。使用QuikChange Ⅱ XL定点诱变试剂盒(Stratagene公司)诱导linc00152序列突变(MUT)。将WT序列(含miR-4767结合位点)和MUT(缺乏miR-4767结合位点)序列分别亚克隆到萤光素酶基因编码区下游的Dual-Glo Dual-Luciferase载体(Promega公司)中。将HEK293T细胞以3×104个/孔接种到24孔板中，细胞汇合度达70%时，将细胞与双荧光素酶(萤火虫和海肾荧光素酶)报道重组子和mi-4767模拟物或NC寡核苷酸与Lipofectamine 3000共转染48 h。通过Multi-label测量萤火虫或海肾萤光素酶活性(读板器：VICTORTM X2，PerkinElmer公司)，标准化萤光素酶活性。

1.8 生物素化miR-4767的测定 用生物素化的miR-4767-WT/MUT转染HUVEC 48 h后，收集细胞并用PBS洗涤，离心；用裂解缓冲液(Ambion公司)中裂解10 min，将其中50 mL裂解物等分。余裂解物与RNase-free离心管、酵母tRNA(Sigma公司)、链亲和素包被磁珠(Dynal Biotech公司)于4℃下孵育3 h，冷裂解缓冲液洗涤2次，低盐缓冲液洗涤3次，高盐缓冲液洗涤1次；经Trizol纯化后，对HUVEC内的外源linc00152进行qRT-PCR分析。

2 结 果

2.1 linc00152与HUVEC的原位杂交结果 RNA-FISH法结果(图1)显示：linc00152主要位于HUVEC的细胞质中；与免疫球蛋白G(IgG)免疫沉淀物相比，linc00152在富含Ago2的miRNA-核糖核蛋白复合物(miRNP)中的含量更高。

图1 linc00152的荧光原位杂交结果

A：linc00152定位于HUVEC的细胞质，反义探针作阴性对照；B：相比IgG，linc00152在富含Ago2的miRNP中含量更高. Original magnification：×400.**P<0.01

2.2 ox-LDL处理的HUVEC中linc00152与miR-4767的相互作用 linc00152上具有结合的miR-4767的位点，结合自由能低(图2)。图3显示WT和MUT linc00152萤光素酶报道重组子。

图2 linc00152与miR-4767的内源性结合

A：linc00152序列中miR-4767靶向的潜在位点；B：miR-4767结合linc00152的自由能

图3 linc00152插入萤光素酶报道基因载体

结果(图4)显示：miR-4767抑制luc-linc00152-WT的荧光素酶活性(P<0.01)，不影响luc-linc00152-MUT的活性。生物素化的miR-4767-WT探针使HUVEC中linc00152的表达增加(P<0.01)，生物素化的miR-4767-MUT探针无此影响。linc00152过表达、敲减48 h后，HUVEC中miR-4767的水平分别下降、升高(P<0.01)；miR-4767模拟物、RNA拮抗剂转染HUVEC后，linc00152表达分别减少、增加(P<0.05)。

2.3 linc00152可能通过miR-4767影响HUVEC凋亡与迁移 结果(图5)显示：miR-4767增加HUVEC的凋亡，抑制HUVEC的迁移(P<0.05)；linc00152引起的HUVEC的凋亡与迁移的变化与之相反(P<0.05)。

2.4 linc00152可能通过miR-4767影响Bcl2L12及EGFR表达 结果(图6)显示：miR-4767可直接靶向Bcl2L12及EGFR。miR-4767抑制luc-EGFR-WT的荧光素酶活性(P<0.01)，对luc-EGFR-MUT没有明显影响；miR-4767以剂量依赖性方式负向调节Bcl2L12和EGFR的表达(P<0.05)。linc00152正向调节Bcl2L12、EGFR及PI3K的表达，负向调节caspase-7的表达(P<0.01)。

图4 经ox-LDL处理的HUVEC中linc00152与miR-4767的相互作用

图5 MiR-4767及linc00152对经ox-LDL处理的HUVEC凋亡和迁移的影响

2.5 阻断miR-4767后linc00152对HUVEC凋亡与迁移的影响 结果(图5B，图6F)表明：阻断miR-4767后，linc00152敲减引起的HUVEC凋亡增加与迁移减少的作用被减弱；同时，linc00152敲减引起的Bcl2L12、EGFR及PI3K表达降低，caspase-7表达升高的作用被改善。

3 讨 论

LncRNA与心血管疾病有着密切关系，但目前对lncRNA的研究尚处于起步阶段。心肌梗死与lncRNA的关系在最近的一项来自基因芯片的实验[5]中得到证实。在心肌梗死鼠中，有20个lncRNA转录本表达上调，10个lncRNA转录本表达下调。其中，心肌梗死相关转录本1(MIRT1)表达上调5倍，MIRT2表达上调13倍。另一个心肌梗死相关转录本lncRNA MIAT[6]也被发现，说明lncRNA与心肌梗死的发生、发展存在密切关系，且参与了血管的病理性发生。

LncRNA功能相关机制可能包括：(1)基因印记，如对脊椎动物发育过程中的H19[7]、在X染色体失活中的X染色体特异性失活复合物(Xist)[8]的作用；(2)染色质重塑，如lncRNA对骨架分子HOTAIR的作用[9]；(3)细胞周期调控，如其对哺乳动物细胞生长、凋亡的关键调节因子生长阻滞特异转录物5(Gas5)表达的影响[10]；(4)剪接调控，如其对多种癌症中异常表达的肺腺癌转移相关转录物1(MALAT1)[11]的调控；(5)mRNA降解，如一种被称为半Stau1结合位点RNA(1/2-sbsRNA)的lncRNA通过与mRNA的3’UTR的Alu元件的不完全配对，形成Stau1结合位点，促进Stau1与mRNA相结合，引起mRNA降解[12]；(6)翻译调控，如在缺少人类抗原R(HuR)细胞中的lincRNA-p21可结合蛋白，在细胞中稳定存在并不断积累，与靶mRNA结合后抑制mRNA的翻译[13]。

图6 miR-4767对Bcl2L12和EGFR基因的作用

血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)可同时分泌一氧化氮(NO)和内皮素，两者相互制约，共同参与控制血流量、调节血流速度及调节血管张力。VEGF由VEC分泌，具有多重生理作用，如开放侧支循环和直接诱导内皮细胞增殖等。He等[14]在SVEC4血管内皮lncRNA-p21过表达和敲除的小鼠中发现，敲除lncRNA-p21后，VEC增殖增加、凋亡减少，过表达lncRNA-p21后则VEC凋亡增加、增殖减少；进一步发现，miR-130b对减少VEC增殖的作用是通过被lncRNA-p21竞争性结合实现的。除此之外，lncRNA LOC 100129973靶向处理miR-4767及miR-4707-5p后，VEC凋亡被抑制[15]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与miR-9的表达通过lncRNA HULC调节，影响VEC凋亡[16]。VEC的增殖在lncRNA H19被敲除后停留在G1期，导致其形成毛细血管样结构的能力降低[17]。Michalik等[18]发现，内皮缺氧时，lncRNA MALAT1的表达明显增加；内皮增殖在体内敲除及体外沉默MALAT1后减少；MALAT1被药物抑制后，下肢毛细血管密度降低，表现为缺血后血流恢复速度减慢[19]

目前，lncRNA相关研究还处于起步阶段，对lncRNA的功能及相关机制的认识仍较局限，且仅很少的lncRNA被鉴定具有功能。但随着相关lncRNA数据库的建立与充实、生物信息技术的进步、基因芯片技术及高通量lncRNA表达分析技术的应用和发展，lncRNA将会不断被认识，进而为诊治心血管系统疾病、完整认识预防心血管病提供理论依据。

本研究在linc00152过表达或敲减并用ox-LDL处理HUVEC中发现，miR-4767水平降低或升高，提示Linc00152可能通过与miR-4767的内源性结合发挥作用。Linc00152可能通过miR-4767靶向Bcl2L12和EGFR抑制HUVEC凋亡和促进其迁移；而阻断miR-4767后可改善由linc00152敲减引起的Bcl2L12和EGFR的减少，进而改善linc00152敲减对HUVEC凋亡和迁移的影响。本研究提示，linc00152可能成为改善血管内皮功能和治疗部分心血管疾病的潜在靶点。