芽胞杆菌属产α-淀粉酶的研究进展

徐挺亮,唐诗哲,彭 晶,陈行钢,朱玉玲,周凯燕,周洪波

(中南大学资源加工与生物工程学院,中国湖南长沙410083)

酶是一种主要以微生物为来源的人类需求产品。其中,淀粉酶是能够水解淀粉和糖原的一类酶的统称,它是最早实现工业应用生产,也是迄今产量最大、用途最广的一种酶制剂[1]。根据淀粉酶水解淀粉作用的糖苷键和反应产生的糖端基团的不同,可将淀粉酶分为四大类:α-淀粉酶,系统名称为1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶,是一种从内部随机切开淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子的α-1,4糖苷键的内切型淀粉酶;β-淀粉酶,从底物还原性末端每相隔一个的α-1,4糖苷键顺次水解;葡萄糖淀粉酶,从底物非还原性末端顺次水解α-1,4糖苷键和分枝点α-1,6糖苷键,生成葡萄糖分子;异淀粉酶,只水解糖原或支链淀粉分枝点α-1,6糖苷键,从而切下侧枝[2]。其中,α-淀粉酶是我国目前用途最广、产量最大的工业酶制剂种类之一,同时也是淀粉工业中最为重要的水解酶之一,在酶制剂生产中占有重要地位,在淀粉加工业、纸浆制造、纺织工业、酿造酒精及饲料加工业等领域广泛应用[2～3]。

尽管α-淀粉酶可以来源于多种生物,包括动物、植物和微生物,但是满足工业化生产需求的α-淀粉酶通常从微生物中获得。目前,工业上生产的α-淀粉酶主要来源于5种常见的微生物,包括解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)[4]。其中,芽胞杆菌属(Bacillus spp.)是α-淀粉酶主要的工业生产菌属。

芽胞杆菌属是一类好氧或兼型厌氧的、能够产生抗逆性芽胞的杆状细菌,一般为革兰氏阳性,主要分布于土壤、植物体表以及水体中。其内生孢子状态对热、紫外线、电磁辐射和部分化学药品均具有很强的抗性[5]。芽胞杆菌是工业中十分常用的酶制剂生产菌株,一般能够分泌许多种胞外产物,如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶及脂肪酶等[6]。尽管研究发现大多数芽孢杆菌可以产生胞外淀粉酶,但目前用于工业生产α-淀粉酶的芽胞杆菌菌株主要是解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)和枯草芽胞杆菌(B.subtilis)[4]。其他芽胞杆菌如嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)等也有作为α-淀粉酶生产菌株的报道[7～9]。

在传统的芽胞杆菌属工业生产α-淀粉酶中,由于处理步骤、温度控制和pH等环境因素易于调控等优势,液体深层发酵(submerged fermentation,SmF)是发酵方法的首选。而近年来,α-淀粉酶的固态发酵(solid state fermentation,SSF)也已经取得了很大进展,正逐渐取代传统的SmF[4]。

本文综述了国内外目前主要用于α-淀粉酶工业生产的芽胞杆菌属菌株、发酵培养基及部分的发酵参数,梳理了产α-淀粉酶芽胞杆菌的菌种选育的发展过程及当前新型的育种手段,可为α-淀粉酶工业菌株选育和发酵生产提供新参考。

1 α-淀粉酶的种类和性质

随着工业的不断发展,人们对不同特性的α-淀粉酶的需求量不断增加,研究者们目前已经筛选并鉴定了上百种不同的α-淀粉酶[4]。根据最适作用温度的不同,α-淀粉酶可以分为耐高温、中温和低温3种类型。

1.1 耐高温α-淀粉酶

在目前的淀粉糖工业制备中,由于一般是在105～118℃的高温环境下进行淀粉喷射液化,所以α-淀粉酶的热稳定性对下游产业的应用极为重要[10]。早在1973年,Saito等[11]对一株地衣芽胞杆菌分泌的耐高温α-淀粉酶(B.licheniformis αamylase,BLA)的特性进行了详细的研究。结果显示:该酶的相对分子质量为22.5 kD,具有广泛的pH适应范围,最适反应pH和温度分别为9.0和76℃。之后,林剑等[12]对B.licheniformis HM-3产生的BLA进行了酶学性质研究,发现其最适反应pH为6.1～7.0;最适温度范围为75～85℃。张强[13]也报道了B.licheniformis Z-8所产BLA的最适反应pH和温度,分别为6.0和95℃。

产耐高温α-淀粉酶的菌株主要是芽胞杆菌属的微生物,如地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌。同时,也有一些链球菌和古细菌产耐高温α-淀粉酶[14]。但目前工业生产上常采用地衣芽胞杆菌及其突变株。地衣芽胞杆菌适合生长和发酵的温度均比较高,一般发酵温度达42℃,部分地衣芽胞杆菌菌株的最适发酵温度甚至高于45℃[15]。

1.2 中温α-淀粉酶

中温耐热型α-淀粉酶作用的最适温度为50～70℃,90℃以上的处理一般会使其失活,而非耐热性α-淀粉酶作用的最适温度为50℃左右。在烘焙行业中,过量的α-淀粉酶常常会导致面包过粘,而中温α-淀粉酶能够在其淀粉糊化时具有活性,在焙烤过程中则逐渐失活,最终在焙烤完成时丧失活性[16]。因此,中温α-淀粉酶在面包烘焙行业中具有不可替代的作用。

在淀粉酶制剂工业上,B.amyloliquefaciens BF7658菌株及以此菌株为基础获得的重组、突变菌株是主要的中温α-淀粉酶生产菌株[2]。其中,中温α-淀粉酶基因主要来源于两种芽胞杆菌:解淀粉芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌,二者产生的中温α-淀粉酶分别被称为解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶(B.amyloliquefaciens α-amylase,BAA)和枯草芽胞杆菌 α-淀粉酶(B.subtilis α-amylase,BSA)。这两种α-淀粉酶的理化特性有着明显的区别:BAA属液化型,而BSA为糖化型。相比之下,BAA的酶学性能略优于BSA,是市场和工业应用中的主要酶种[17]。刘洋等[18]对 B.amyloliquefaciens M23 产生的BAA进行了一系列酶学性质检测,结果显示:该酶的相对分子质量为58 kD,最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0;在55℃条件下保温15 min基本丧失活力,而在添加10 mmol/L的Ca2+条件下能显著提高酶的热稳定性。目前,一般工业应用中BAA的相对分子质量大多在50～60 kD,在40～60℃范围内有较高的稳定性,其最适作用温度约为60℃,最适作用pH为6.0～7.0,并且其酶活对Ca2+有很强依赖,在弱碱环境下较为稳定[2]。由于生产BAA的解淀粉芽胞杆菌发酵最适温度较低,一般需控制在34℃以下,所以该菌发酵过程中将耗费大量冷却用水[17]。

1.3 低温α-淀粉酶

淀粉是单胃动物能量的主要来源,幼龄动物由于消化系统发育不成熟,淀粉酶往往分泌不足,此时通过补充外源性营养消化酶能够在一定程度上弥补该缺陷。然而动物生理环境温度一般为37～42℃,中温α-淀粉酶在动物消化道内可发挥的作用甚微[19]。低温α-淀粉酶的最适作用温度相对于中温α-淀粉酶要低20～30℃,在0℃下仍具有一定的活性,适合作为动物外源性营养消化酶。此外,低温α-淀粉酶也广泛用于馒头制作等过程[20]。

低温α-淀粉酶在枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌等菌种中均有报道[21～23]。Ikawa等[24]分离到一种来源于枯草芽胞杆菌,以不同的水解效率水解可溶性淀粉、支链淀粉、糖原、直链淀粉、葡聚糖等多种底物的低温α-淀粉酶,其相对水解率(可溶性淀粉为100%)分别为100%、133%、94%、39%、12%。该酶在45℃下十分稳定,但在60℃下几乎完全失活。2017年,窦少华等[25]发现了一株来源于海洋的产低温α-淀粉酶的菌株Bacillus thuringiensis dsh19-1,该菌株的最适生长温度为20℃,发酵粗酶液最适作用温度为20℃。由于低温α-淀粉酶成本高于目前的商业用酶,因此该酶在应用推广上还存在一定的困难[26]。

2 生产菌株选育研究现状

2.1 诱变育种

诱变育种作为工业菌株育种的重要方法之一,它具有操作简便、速度快、收效大等优势。经过对菌株不断地诱变改良,目前工业上所用菌种产生α-淀粉酶的能力得到了很大的提高。潘风光等[27]认为,诱变处理能够改变或破坏芽胞杆菌中部分酶的合成调控机制及其分泌调节机制,首先筛选出抗代谢阻遏的突变株或者蛋白质分泌能力提高的突变株,随后通过多轮诱变处理,逐渐积累有益的、有效的基因突变位点,最终获得α-淀粉酶高产突变菌株。传统的物理、化学诱变方法有紫外诱变法、亚硝基乙基脲法、甲基磺酸乙酯法等。近年来,许多新型的诱变方法被用于芽胞杆菌以提高其酶产量或改变菌株特性。例如:Cregenzán-Alberti等[28]利用高温脉冲电场诱变处理B.subtilis DSM618的内生孢子,得到的突变株在123℃的条件下更具耐热性;Ma等[29]报道,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变包含有重组质粒的B.subtilis 168,重组质粒中碱性α-淀粉酶的产酶效率从1.31 U/(mg·h)增加至1.57 U/(mg·h);Ma等[30]还利用ARTP方法对B.subtilis WB600菌株进行诱变处理,发现其α-淀粉酶活力较出发菌株提高了35%;赵天惠等[31]利用脉冲强光诱变,经初筛和复筛,获得了兼具耐受高温、强酸、高浓度盐的变异菌株B3和B7,其产出的α-淀粉酶的酶活比原始菌株分别提高了67%、77%;鄢洪德等[32]采用超临界CO2诱变B.subtilis K2,发现其所产淀粉酶的活力提高了33%。尽管诱变能够获得酶活较高和耐受性较强的突变株,但诱变菌株的稳定性一般较差,需要经过传代检验以保证其性质能够遗传[27]。另外,由于诱变后同时存在着大量的正、负突变,所以为了快速获得酶活提高很大的突变菌株,高通量筛选方法的建立才是诱变育种需解决的关键问题。

2.2 基因工程育种

基因工程育种可通过将外源遗传物质导入受体细胞的方式或通过对菌种自身基因的精确修饰来达到功能性目的,是在分子水平上对工业微生物菌种进行的遗传操作[33]。迄今,构建基因工程菌株进行发酵产α-淀粉酶的例子已经越来越多。

早在1978年,Nomura等[34]就使用基因工程技术将整合有amyE基因的质粒转化枯草芽胞杆菌,得到具有产α-淀粉酶能力的转化菌株。1981年,Palva等[35]使用pUB110作为运载体将来源于B.amyloliquefaciens的α-淀粉酶基因克隆到B.subtilis中,筛选出了抗卡拉霉素的B.subtilis基因工程菌株,由于基因拷贝数和质粒上启动子的改变,其α-淀粉酶活力比原始的野生型菌株高500倍。1987年,Vehmaanperä等[36]也成功克隆了 BAA酶基因,将其进行重组后获得了B.subtilis ALKO-84,并用于工业化生产α-淀粉酶。由于游离质粒存在无抗生素压力下易丢失的特点,在生产过程中需要投入较多相应的抗生素。1998年,王磊等[37]建立了一套整合载体,将来自嗜热脂肪芽胞杆菌的高温α-淀粉酶基因以及一段氯霉素抗性基因随机整合到B.subtilis 1A289的染色体上,并通过提高菌株的抗氯霉素能力以及重复地进行整合步骤,不断提高整合到染色体上高温α-淀粉酶基因的拷贝数,最终将拷贝数增至7个以上。在无抗生素选择压力的情况下,该菌种仍能保持产酶220 U/mL。相较游离质粒型的基因工程菌,该菌产酶稳定性良好,从根本上克服了早期质粒型基因工程菌的质粒易丢失的现象。2009年,牛丹丹等[38]将α-淀粉酶编码基因amyL导入BLA生产菌中,使该菌α-淀粉酶的产量提高了约89.2%。此外,2017年,李由然等[39]成功实现了由新兴的CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的B.lichenifor-mis ATCC14580淀粉酶编码基因amyL的敲除,在该菌绝大多数α-淀粉酶丧失活性的条件下,其生长速率仍未受到显著影响。李由然团队将CRISPR/Cas9系统成功运用于地衣芽胞杆菌基因组的编辑,为应用这种新型的基因编辑工具于该菌基因功能研究及菌种改造提供了参考。

3 发酵研究现状

芽孢杆菌属工业化生产α-淀粉酶的大规模发酵制备方法主要分为两种:液体深层发酵和固态发酵[40]。

3.1 α-淀粉酶的液体深层发酵

通常,由于液体发酵具有对温度、pH、通气量、溶氧和水分等过程参数控制方便,使用商业化的培养基配方,灭菌和最终产品的纯化过程容易等优点,工业上优先选用液体深层发酵来对微生物酶制剂进行大规模的生产。但是,这种方法对底物消耗较快,需要在发酵过程中不断进行流加补充[4]。早在1917年,一种来自枯草芽胞杆菌的α-淀粉酶就被认为是适应工业化生产的酶。但直到1950年左右,这种酶才开始进行商业化生产,并借鉴和引入了当时抗生素工业常用的液体发酵[41]。α-淀粉酶是一种诱导酶,通常在淀粉或者其水解产物存在的条件下被诱导。芽胞杆菌属中不同菌种对培养基中不同的底物具有特异性。例如:对于工业生产中温α-淀粉酶常用的B.amyloliquefaciens BF7658,其诱导效果依次是可溶性淀粉、麦芽糖、甘露醇、阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖[42]。此外,李志鹏[2]对B.amyloliquefaciens YL1-5(B.amyloliquefaciens BF7658变异株)的发酵培养基进行了优化,优化后的培养基为玉米粉16%、棉籽饼粉8%、玉米浆粉1.0%、沸石1.0%、CaCO30.8%,其采用的底物均为易得的富含淀粉类的农副产品。Syu等[43]对一株产α-淀粉酶的B.amyloliquefaciens(ATCC 23350,CCRC 10268)的发酵结果的分析显示:以葡萄糖为碳源时,细菌生长速度很快,而以麦芽糖为碳源时能够获得相对较高的生物量、酶活力和产酶效率。李习[44]通过正交实验对B.licheniformis BG14的培养基进行了优化,采用黄豆粉0.7%、麸皮1.0%、可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1.0%、K2HPO40.5%作为发酵培养基,结果显示:该菌在优化后的发酵培养基中所产耐高温α-淀粉酶的活力达到334.32 U/mL,比初始发酵培养基的酶活力提高43.09%。范如意等[15]优化了B.licheniformis CBBD302产高温α-淀粉酶的发酵培养基底物,将碳氮源由乳糖和豆饼粉改为木糖和豆饼粉,提高了其产酶量。表1显示了其他部分芽胞杆菌属菌株在液体发酵培养基中使用的培养基底物及其酶活产量,为研究者对各类菌株选择相对应的底物提供参考。从表1中可知,大多数培养基配方使用淀粉类作为液体培养基中的主要底物和主要碳源。

不同菌种的温度、pH、通气量、溶氧和水分等发酵参数有很大的差异,研究者需要结合选用的菌株、发酵设备、产地气候及生产成本等方面综合进行考虑。例如:对于解淀粉芽胞杆菌这类好氧菌,发酵生产过程中通气十分重要。研究表明,如果在3 L搅拌罐生物反应器中增加1 vvm的通气量,解淀粉芽胞杆菌所产淀粉酶的活力将增加至2倍[45]。一般来说,较低的搅拌速度对解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶的合成会更有利[46]。此外,在大规模发酵罐生产中,消除气泡也是一个关键因素。尤其在菌体生长期和产物合成期,消除泡沫更为重要,否则极易造成漫灌跑液、染杂菌、降低产量等一系列不利影响[47]。

3.2 α-淀粉酶的固态发酵

固态发酵被定义为在没有或几乎没有游离水的情况下发生的发酵过程,适用于生长过程中对水分要求较低的微生物[56]。它在生物浸出、生物选矿、生物修复、生物制浆等过程中均有应用,有着许多的优点,如:较高的发酵生产率、产品最终浓度和产品稳定性;较低的代谢抑制率;对发酵过程无菌性要求较低;设备要求简单;废料可再利用;污水产生少等[4]。虽然传统上SmF一直用于工业生产酶制剂。但随着SSF反应器设计的不断改进,具有优化生产参数的SSF对进一步提高淀粉酶产量具有巨大的潜力。吴大治等[3]针对B.amyloliquefaciens BF7658的一株变异菌种,直接以麸皮为原料的固态发酵法生产α-淀粉酶。其采用的初始条件为:培养基初始含水量60%,起始pH自然,液体接种量5 mL/kg,37～39℃下发酵48～60 h。结果显示:SSF法产α-淀粉酶的水平为SmF法的4～5倍,并且成本更加低廉。α-淀粉酶生产菌株B.licheniformis M27在含有15%葡萄糖的液体培养基中发酵培养后,其发酵液酶活为19.550 U/mL,而该菌在以相同百分比(150 mg/g)的小麦麸皮作为固态培养基进行发酵后,其酶活水平为1 450 U/gds(每克初始干物质)[57]。在SSF的固态培养基中,麦麸似乎是许多α-淀粉酶生产研究者首选的基质。表2列举了其他一些菌株使用相应的农业副产物、废弃物作为底物,进行SSF生产所得α-淀粉酶的酶活。表2表明:除麸皮外,其他农业废弃物如香蕉皮、土豆皮、胡瓜皮、香蕉残穗,以及在农产品加工过程中产生的残渣如米糠、蔗渣、花生油渣、扁豆壳等,都是SSF产α-淀粉酶的有效底物。此外,SSF的成功很大程度上取决于控制合适的活化期、接种量、水分含量和pH等条件,这些参数对于不同菌种的差异性较大,需要研究者针对所选用菌株进行相关探索。

3.3 无机盐等微量组分对α-淀粉酶产量的影响

磷酸盐在微生物的一级和二级代谢产物的合成中起重要作用,会影响到微生物的生长和α-淀粉酶的产量。根据不同菌体生长及产酶需要,磷酸盐的添加量也略有差异[64]。例如:李志鹏[2]在摇瓶水平进行B.amyloliquefaciens YL1-5的发酵培养时,添加了0.5%Na2HPO4和0.45%NaH2PO4,既为菌株提供了适量的磷酸盐,也对发酵液的pH起到了缓冲作用。一般地,低浓度的磷酸盐会导致芽胞杆菌的细胞浓度降低,酶合成延滞,而高浓度的磷酸盐在芽胞杆菌产酶过程中也会降低α-淀粉酶的产量[42]。

通常,培养基中CaCl2和MgSO4的添加会增加 α-淀粉酶的产量,而且 Mg2+、Ca2+、Na+对 α-淀粉酶的产量和酶活发挥主要作用[65]。其中,除少数Ca2+非依懒型α-淀粉酶外,Ca2+对工业生产的α-淀粉酶的稳定性起到关键作用[66]。例如:在上述报道的解淀粉芽胞杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵培养基中,均添加了少量Ca2+,分别为1.6%的CaCO3和 0.3%的 CaCl2[2,15]。

一般认为,培养基中的肌醇、D-山梨糖醇等单糖及吐温80、Triton X-100等洗涤剂会抑制淀粉酶的产量,而其他的无机和有机盐如KCl、苹果酸钠和琥珀酸钾等则有利于淀粉酶产量增加。此外,在培养基中加入氨基酸如异亮氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸也被发现对淀粉酶生产至关重要[67]。

表1 液体深层发酵中部分芽胞杆菌属菌株所产α-淀粉酶的酶活Table 1 Bacillus spp.α-amylase activity in SmF

表2 固态发酵中部分芽胞杆菌属菌株所产α-淀粉酶的酶活Table 2 Bacillus spp.α-amylase activity in SSF

4 结语

诱变育种产生突变的位置是随机的,该方法具有高度不确定性。短时间内使用诱变育种难以大幅度提高酶的活力,需要反复进行大量的筛选工作才能获得较理想的突变菌株。基因工程虽然能通过精确修饰改造微生物,但要求的技术难度较高,且对于一些来源不明的外源基因需要进行严格审查。研究者们应该结合菌种的实际情况,选择相应的诱变或基因工程改造手段,以获得生产产能更高、耐受性更强的α-淀粉酶生产菌株。在芽胞杆菌属α-淀粉酶发酵工业中,发酵培养基底物的选择对α-淀粉酶的发酵生产起着至关重要的作用。其中,新兴的固体发酵法在产α-淀粉酶过程中能够更好地利用农业及农产品加工过程中的废弃物作为发酵培养基,是一种既高能效又环境友好的生产方式。此外,发酵工艺参数等细节的改良也能够提高α-淀粉酶的产量。

随着科技的进步、工业的发展,以及国家对环境保护的重视,淀粉酶在发酵、食品、粮食加工、造纸、纺织等轻工业的运用更加广泛。未来对不同酶学性质的α-淀粉酶也将有更广泛的需求,通过寻找极端环境微生物中新的α-淀粉酶编码基因或者通过生物信息学预测并改造已有的基因序列是开拓新型α-淀粉酶市场、开发新应用领域的有效途径。此外,虽然α-淀粉酶发酵产业已经较为成熟,但其下游工艺(酶的分离、纯化等)仍占据着主要生产成本。通过构建缺陷性(如:蛋白酶缺陷性)或良好的选择性通透型菌株以产生纯度更高的发酵液,或者完善下游分离产业工艺,是解决该问题的主要途径。相信随着生产成本的降低和应用领域的拓展,α-淀粉酶将在国民经济中发挥更大作用。