土壤溶磷微生物溶磷、解磷机制研究进展

秦利均,杨永柱,杨星勇*

(1.重庆师范大学生命科学学院,中国重庆401331;2.重庆市九龙坡区农业委员会,中国重庆401331)

磷是植物正常生长发育所必需的矿质元素,参与植物呼吸作用、细胞分裂、能量转化和生物合成等重要的生理生化过程。土壤中的磷以无机磷和有机磷两种形式存在,虽然存储量大,但其中约95%的磷不能被植物直接吸收利用[1]。据统计,全世界约有43%的耕地土壤缺乏能被植物吸收利用的有效磷,而我国土壤中缺少有效磷的耕地占70%以上[2]。为保证农业生产需求,人们常常通过大量施用磷肥来弥补有效磷的供应[3]。但植物对其利用率较低,当季利用率仅有5%～25%,肥料中 80%以上的磷与土壤中的 Fe3+、Ca2+、Mg2+、Al3+等阳离子结合为难溶性的磷酸盐,不能被植物吸收利用,这使磷成为植物生长发育的限制因素[4～5]。农业生产用磷肥开采自磷酸岩,而按目前的开采速度,全球磷酸岩储量将在50～100年内耗尽[6]。此外,磷肥的大量使用又会导致土壤养分失衡,诱发微量元素如铁、锌的缺乏。因此,如何提高土壤磷的利用率成为热点问题之一,溶磷微生物(phosphate solubilizing microorganisms,PSMs)作为土壤磷循环中的重要成员也成为研究焦点。

1 土壤磷素及溶磷微生物

土壤中不能被植物吸收利用的磷分为有机态磷和无机态磷。有机态磷来源于动植物和人类活动等,主要包括磷脂、植酸类、核酸、磷蛋白等,需通过矿化作用分解为无机磷才能供植物吸收利用。无机态磷主要包括土壤中难溶的矿物态磷,如Ca-P、Fe-P、Al-P化合物等形式,需将其溶解为可溶性的磷酸根离子后才能被植物吸收[7]。

自然界中,土壤溶磷微生物是土壤磷循环中的重要一员,能将无效磷转化为有效磷供植物吸收。溶磷菌的活动不仅能为植物提供足够的有效磷,还能分泌生长素等植物生长调节剂促进植物生长[8]。此外,部分溶磷菌还可以分泌嗜铁素[9]、抗生素以及ACC脱氨酶等[10]。同时,也有部分溶磷菌能提高重金属土壤的生物修复效率[11]。研制环境友好型的溶磷菌菌肥[12],并将其替代传统化肥,可减少环境污染、改良土质、增加土壤肥力。

溶磷微生物主要包括溶磷细菌(phosphate solubilizing bacteria,PSB)、溶磷真菌(phosphate solubilizing fungi,PSF)和溶磷放线菌(phosphate solubilizing actinomycete,PSA)。在土壤中,溶磷细菌占PSMs总量的1%～50%[13],主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)和沙雷氏菌属(Serratia)等;溶磷真菌仅占0.1%～0.5%[14],主要有青霉菌属(Penicillium)、曲霉菌属(Aspergillus)、AM菌根属(Arbusclar mycorrhiza)等;溶磷放线菌主要有链霉菌属(Streptomyces)和小单胞菌属(Micromonospora)等[14]。

溶磷菌的溶磷、解磷过程十分复杂,其潜在机制也因菌种不同而各不相同。其可能机制如图1所示,主要包括有机酸酸解作用、酶解作用和释放H+等[15]。其相关溶磷、解磷效率[16～19]如表 1 所示。目前,对PSMs溶磷、解磷机制认识的局限性限制了溶磷菌及相关菌肥的广泛应用。

2 无机矿物磷溶解途径

无机矿物磷的溶解主要与PSMs中小分子有机酸的分泌有关[20]。PSMs产生的有机酸包括葡萄糖酸、草酸、酮基葡萄糖酸、苹果酸、柠檬酸等[21～22]。PSMs菌种不同,其产酸的种类和含量也各不相同,溶磷能力也不一样[23]。将柠檬酸和草酸添加到土壤中,能有效提高土壤的溶磷效率。关连珠等[24]发现,草酸和植酸酶的使用能显著提高土壤有效磷的含量。

溶磷菌分泌的有机酸能够降低土壤pH,促进微溶的矿质磷溶解(包括磷酸钙和磷灰石等)[25];同时能与 Fe3+、Ca2+、Mg2+、Al3+等阳离子螯合,即有机酸离子与Pi在土壤中竞争(直接物理竞争或静电竞争)相同的吸附位点[26],释放磷酸根离子。已有研究报道,欧文氏菌(Erwinia)对磷矿石的高效溶解是由于葡萄糖在葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)催化下发生直接氧化反应(非磷酸化氧化)产生葡萄糖酸[27～28];而葡萄糖酸通过介导直接酸化途径溶解磷矿石,使其在葡萄糖酸含量相对较低的情况下,也能释放大量的Pi[29]。此外,根据菌种的不同,有的溶磷微生物可将葡萄糖酸进一步氧化为2-酮基葡萄糖酸。相比葡萄糖酸,2-酮基葡萄糖酸具有更高的溶磷效率[30]。

一些PSMs在GDH相关基因突变失活后不能溶解石灰性土壤中的难溶磷酸盐[31]。吡咯喹啉醌(pyr-roloquinoline quinone,PQQ)作为GDH的辅酶,共同参与葡萄糖等碳源的无机磷代谢,并起着重要的调控作用[31]。焦子伟等[32]将水生拉恩氏菌(Rahnella aqautills)HX2菌株的pqq基因簇导入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,结果显示:工程菌株DH5α能分泌更多的有机酸,特别是葡萄糖酸,与原菌株相比,工程菌株DH5α拥有更强的溶解矿质磷能力。类似的还有分离自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的矿物磷酸盐溶解基因gabY[33],其与pqq基因没有明显同源性,可在直接氧化途径表达或(和)调控中发挥替代作用,增加溶磷能力[27,34]。

表1 溶磷微生物的溶磷、解磷相关指标[16～19]Table 1 Phosphorus solubilization and dissolution indicators of PSMs

图1 溶磷微生物(PSMs)溶解难溶性磷的潜在机制PSF:溶磷真菌;PSB:溶磷细菌;PSA:溶磷放线菌。Fig.1 Potential mechanisms for the solubilization of insoluble phosphorus by PSMsPSF:Phosphate solubilizing fungi;PSB:Phosphate solubilizing bacteria;PSA:Phosphate solubilizing actinomycete.

有些PSMs只有在NH4+存在时才能溶解无机磷酸盐。Halder等[35]发现有的固氮菌需要NH4+的存在才能溶解羟基磷灰石;Asea等[36]发现,相比于以NO3-为唯一氮源,以NH4+为唯一氮源时,培养介质pH显著降低,溶磷菌溶磷量显著增加。NH4+同化作用过程中,利用ATP转换时产生的能量,通过质子泵释放H+,使pH降低,从而有助磷的溶解[20,37]。土壤pH与溶磷效率有一定的相关性,但pH的下降并不是微生物溶磷的必要条件[38]。

此外,有一些PSMs在土壤难溶磷的溶解过程中起着补充作用。例如:土壤中的硫杆菌(Thiobacillus)通过产生的H2S与Fe-P化合物反应生成FeSO4,从而释放出磷酸根离子[39];桔灰青霉菌(Penicillium aurantiogriseum)不分泌有机酸,通过吸收Ca2+,从而释放磷酸根以溶解钙磷酸盐[40];还有些PSMs产生的胞外多糖能够显著增强溶磷作用,并通过呼吸作用产生CO2,导致pH降低,使部分磷酸盐溶解[41]。有研究表明:溶磷微生物分泌的磷酸酶也能够溶解无机难溶磷,如已经确定的无机磷酸酶——焦磷酸水解酶,它可以将焦磷酸盐水解为磷酸盐离子,且其酶活性在一定范围内随pH增高而增加[42]。

3 有机磷溶解途径

有机磷的矿化主要依靠酶解作用,这些酶包括磷酸酶、植酸酶、C-P裂解酶、核酸酶等[43]。其中,磷酸酶和植酸酶(肌醇六磷酸酶)最为常见,它们的底物主要存在于土壤中[44]。

磷酸酶包括酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和无机焦磷酸酶等,能水解磷酸酯键释放无机磷酸。根据底物特异性,磷酸酶还可进一步分为特异性磷酸酶和非特异性磷酸酶。磷酸单酯酶可以从磷酸单酯化合物中解离磷酸基团;而磷酸二酯酶可以水解核酸中的磷酸二酯键。植酸酶可通过催化肌醇六磷酸中磷酸单酯键的水解,释放出肌醇磷酸酯和无机磷酸酯[45]。C-P裂解酶裂解有机磷酸酯的C-P键。D-α-甘油磷酸酶是一种稀土磷酸酶,由其催化的反应产物被鉴定为甘油和无机磷酸盐[46]。此外,有报道指出许多酶都可以作为有机磷酸酯清除剂,从核苷酸和糖磷酸中释放无机磷酸盐[47]。

磷酸酶随着pH的变化,显示出不一样的催化能力。在pH小于6时,酸性磷酸酶占优势;pH大于7时,碱性磷酸酶更普遍。根据已分离出来的磷酸酶基因及其特征,人们将非特异性磷酸酶分为 A、B、C 三类[48～50]。Rossolini等[51]从摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)和斯氏普罗威登斯菌(Providencias tuartii)分离出具有高度同源性的A类磷酸酶基因,并经研究表明这些基因垂直衍生自共同的祖先;同时,该团队还证实了各细菌磷酸酶家族(A、B和C)存在各种保守结构域和特征基序。在酸性或中性的土壤条件下,由acpA、phoC和napA等基因编码的酸性磷酸酶表现出较强溶磷活性。Fraga等[52]从摩氏摩根氏菌(M.morganii)克隆了napA基因,将其转移到洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)IS-16中后,后者酸性磷酸酶活性明显提高,溶磷能力显著增强。

磷酸酶的产生主要是通过无机磷酸盐(Pi)浓度进行调节。当处于低Pi条件下时,涉及Pi信号转导的操纵子调控元件被由PhoB构成的PHO调节因子激活,碱性磷酸酶(phoA基因编码)被大量表达;随着Pi的浓度增加,碱性磷酸酶的活性受到抑制[53]。

大多数碱性磷酸酶受Pi抑制调控,但部分酸性磷酸酶,如摩氏摩根氏菌(M.morganii)和斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)产生的不被大量磷酸盐抑制的A类酸性磷酸酶(phoC基因编码)和不被少量磷酸盐抑制的B类酸性磷酸酶(napA基因编码),均表现出不被高水平磷酸盐抑制的特有磷酸酶活性调控模式[54～55]。除此之外,磷酰乙醛水解酶和C-P裂解酶也仅在磷酸盐限制条件下被诱导[56～57]。在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MF3菌株中,编码酸性磷酸酶的apo基因的表达受生长温度调节;在福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)中,编码三磷酸腺苷双磷酸水解酶的apy基因,以及其他相关等位基因均以温度调节方式表达[58]。

小分子有机酸也可促进有机磷的矿化。Patel等[59]发现,在有机酸阴离子(如葡萄糖酸盐、柠檬酸盐)的存在下,肌醇六磷酸钙(植酸钙)的水解效率得到提高。有机酸阴离子的存在可以改善肌醇六磷酸钙盐的溶解性,从而提高解磷效率。其增溶机理与植酸酶的水解是互补的,有机酸阴离子通过与二价金属螯合作用提高肌醇六磷酸酶活性,但其确切的机制仍不清楚[60]。

4 展望

我国乃至全世界耕地土壤缺磷现象普遍较重,土壤中磷素的固定和转化效率影响土壤磷的积累及利用。基于土壤溶磷微生物的优点,针对PSMs研制相关菌肥是提高土壤有效磷含量,促进植物生长发育,发展可持续农业的重要手段之一。研制PSMs菌肥,我们所面临的挑战还有很多,例如:实验室培养的高效溶磷菌无法在自然环境中占据优势地位,生存能力差,溶磷、解磷能力退化或受到极大抑制。

为改善土壤磷的利用效率,对PSMs的溶磷、解磷机制研究必不可少。未来可从以下几个方面展开深入研究:1)从溶磷菌在土壤中的生态关系入手,即探究土壤pH、深度、温度和海拔等对溶磷菌的生存和溶磷、解磷能力的影响;2)很多组合菌肥比单一菌肥有着更强的生存能力和溶磷、解磷能力,深入解析其差异,有利于制备更高效的PSMs菌肥;3)分离克隆溶磷、解磷相关基因,了解其表达调控机制,利用基因工程手段改良溶磷菌株,得到更高效的溶磷菌株。

相信随着研究的深入,PSMs菌肥能代替化肥促进植物生长,提高土壤有效磷含量,同时改善土壤环境,降低环境污染,使农业生产更好更快的发展。