底质条件对加州扁鸟蛤潜沙行为及呼吸代谢酶活性的影响

李东霖，董莎莎，李东东，李文昊，闫喜武，聂鸿涛

(大连海洋大学水产与生命学院，辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁 大连 116023)

加州扁鸟蛤(Clinocardiumcaliforniense)又称为鸟蛤，俗称鸟贝，隶属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、帘蛤目(Veneroida)、鸟蛤科(Cardiidae)、扁鸟蛤属(Clinocardium)，为冷水种类，在美国西岸的加利福尼亚经白令海、霍尔木兹海、日本海及日本的北海道与本州北部及朝鲜海峡到黄渤海均有分布[1]。加州扁鸟蛤因肉质鲜美，已成为了一种备受关注的经济贝类。目前对其生理习性方面的探究较少，大部分研究均集中在苗种培育及增养殖技术、繁殖周期和繁殖生理等领域[2-8]。

碱性磷酸酶(AKP)是动物代谢过程中重要的调控酶，是一种非特异性的磷酸水解酶,能催化磷酸单脂水解及磷酸基团的转移反应,对动物的生存具有重要的意义[9-10]。AKP对水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的分泌及形成均具有重要作用，是水产动物赖以生长、生存的重要酶类之一[9]。琥珀酸脱氢酶(SDH)参与三羧酸循环和氧化磷酸化作用，SDH活力可在一定程度上反映有氧代谢水平。温度是影响水产动物呼吸代谢酶活力最重要的因素之一[11-13]，底质条件是影响水产动物存活和生长的另一重要生态因子，可影响其生存、发育、生长和繁殖等行为[14-19]。因此，开展底质条件对加州扁鸟蛤的潜沙行为及呼吸代谢酶活性的影响研究十分必要。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用加州扁鸟蛤采自辽宁省大连湾海域，于2016年10月25日运回实验基地。从中精选出贝壳完整、健康有活力的个体，先在塑料水槽(50 cm×30 cm×35 cm)中暂养一周。海水盐度为30，空调控制室温为17 ℃，水循环系统控制水温范围为(15.0±0.5)℃，pH值范围为8.0～8.1，溶解氧范围为6.5～7.0 mg/L，每天换水一次，每天喂一次饵料(用200目筛绢网，搓洗螺旋藻粉，形成浓绿色溶液，每个水槽一次投喂50 mL 0.1 g螺旋藻粉，饵料密度 1.0×104cells/mL)。

1.2 实验方法

设定含沙量梯度为0、25%、50%、75%和100% 5个梯度，底质厚度设定为6 cm(实验所选的加州扁鸟蛤壳长大都大于5 cm，底质厚度为6 cm时能满足加州扁鸟蛤的潜沙活动)，每个梯度3个平行实验，在每个水槽中放5只加州扁鸟蛤，加州扁鸟蛤生物学数据，见表1。每12 h观察并记录实验组加州扁鸟蛤的潜沙行为。养殖1个月后，各组加州扁鸟蛤生长、摄食状态良好，不再有死亡现象。随机选取每个水槽中的2个个体，采集组织样本，制作组织匀浆，测定AKP、SDH和LDH 3种酶的活性，取样前24 h停止投喂饵料。实验结束时，统计每个含沙量下加州扁鸟蛤的存活率。

设定底质厚度为0、1.5、3.0、4.5和6.0 cm 5个梯度，底质含沙量为75%，每个梯度做3个平行试验组，在每个水槽中放5只加州扁鸟蛤，加州扁鸟蛤生物学数据，见表2，其他实验条件同1.1实验材料所述。各实验组的加州扁鸟蛤养殖1个月后，随机选取每个水槽中的2个个体，采集组织样本，制作组织匀浆，测定各种酶的活性，取样前24 h停止投喂饵料。实验结束时，统计不同底质厚度实验组的死亡率。

表1 不同含沙量下加州扁鸟蛤的生物学数据Tab.1 Biological characteristics ofC.californiensein different sand/mud ratio n=3

表2 不同底质厚度下加州扁鸟蛤的生物学数据Tab.2 Biological characteristics ofC.californiensein different substrates thickness n=3

1.3 样品制备和酶活力测定

取样时在冰上用无菌镊子、解剖刀等工具将双壳剖开，取出其内脏组织团，电子天平(赛多利斯，上海)称重(每个个体取0.3 g组织)，在冰水浴的条件下用玻璃匀浆器匀浆后，离心机离心15 min(4 ℃、3 500 r/min)，取上清液进行酶活力检测。蛋白含量及相关呼吸代谢酶活力的测定均按照南京建成生物公司的检测试剂盒说明书进行。

1.4 数据分析

原始数据经Excel 2010初步整理，采用SPSS 19.0中的单因素方差分析(one-way ANOVA)，对数据进行统计分析，并进行Fisher’s LSD 多重比较。统计结果用(平均值±标准误)表示，数据表示方式(MEAN±SEM),差异显著性水平以P<0.05为判定标准。

2 结果

2.1 含沙量和底质厚度对加州扁鸟蛤的潜沙率和存活率的影响

随着底质含沙量的升高，每12 h观察并记录实验组加州扁鸟蛤的潜沙行为，发现加州扁鸟蛤的潜沙率不断升高，含沙量为50%～75%时，潜沙率最高达到100%，潜沙深度最大为5.6 cm(表3)。在0～25%含沙量范围，潜沙率很低；在底质含沙量75%时，存活率最高达93.3%，说明此环境适合加州扁鸟蛤生存。含沙量对加州扁鸟蛤的潜沙率和存活率均有显著性影响(P<0.05)；含沙量在50%和75%时潜沙率显著高于其他3组(P<0.05)；各组含沙量之间的存活率，均存在显著性差异(P<0.05)。

表3 含沙量对潜沙行为的影响Tab.3 Effect of sand/mud ratio on burrowing behavior

注:同列不同字母代表差异显著(P<0.05)，下同。

随着底质厚度的增加，潜沙率明显上升，并在底质厚度为4.5和6.0 cm时达到最高100%，潜沙最深为5.8 cm左右。底质厚度在4.5 cm时存活率最高(表4)。底质厚度对加州扁鸟蛤的潜沙率和存活率均有显著影响(P<0.05)；厚度在4.5和6.0 cm时的潜沙率显著高于其他3组(P<0.05)；0、1.5和3.0 cm时的存活率显著低于其他两组(P<0.05)，且三者之间无显著性差异(P>0.05)。

表4 底质厚度对潜沙行为的影响Tab.4 Effect of different substrates thickness on burrowing behavior

2.2 含沙量和底质厚度对加州扁鸟蛤碱性磷酸酶活力的影响

随着含沙量的升高，AKP酶活性总体趋势为：先缓慢上升后有所下降。在含沙量为75%时，酶活性达到峰值；含沙量为时0，即底质全泥时，AKP酶活性最低(图1)。根据单因素方差分析比较，含沙量为75%时，酶活性与其他4种含沙量实验组差异显著(P<0.05)，其他4组之间无显著性差异(P>0.05)。

图1 含沙量对碱性磷酸酶酶活性的影响(n=3)不同字母(a-e)之间差异显著(P<0.05)。下同。Fig.1 Effect of sand percentage on AKP activity(n=3)Different lowercase letter a, b, c and d indicate significant different between group (P<0.05).The same below.

随着底质厚度的增加，AKP酶活性总体趋势为：先缓慢升高，后稍微降低并趋于稳定。在底质厚度为3.0 cm时，AKP酶活性达到峰值；在底质厚度为0 cm时，酶活性最低(图2)。底质厚度为3.0 cm时，酶活性显著高于其他4组(P<0.05)；底质厚度为0 cm时酶活性显著低于4.5和6.0 cm组(P<0.05)。1.5、4.5和6.0 cm实验组之间无显著差异(P>0.05)。

图2 底质厚度对碱性磷酸酶酶活性的影响Fig.2 Effect of different sediment depth on AKP activity

2.3 含沙量和底质厚度对加州扁鸟蛤琥珀酸脱氢酶活力的影响

随着含沙量的升高，SDH酶活性总体趋势为：先不断升高后趋于平稳，在含沙量为75%～100%时，酶活性达到峰值；在含沙量为0～25%时，即底质含泥多时，SDH酶活性较低(图3)。含沙量对加州扁鸟蛤的SDH酶活性有显著影响(P<0.05)；含沙量为75%和100%时的酶活性显著高于其他3种条件(P<0.05)；0、25%、50% 3种之间也有显著差异(P<0.05)。

图3 含沙量对琥珀酸脱氢酶活性的影响Fig.3 Effect of sand percentage on SDH activity

随着底质厚度的增加，SDH酶活性总体趋势为：先升高再趋于平稳，后稍有降低。在底质厚度为3.0和4.5 cm时，SDH酶活性高；在底质厚度为0 cm时，酶活性最低(图4)。底质厚度为0、6 cm时的酶活性显著低于其他3组(P<0.05)且两者之间无显著差异(P>0.05)；其他3组之间的酶活性无显著差异(P>0.05)。

2.4 含沙量和底质厚度对加州扁鸟蛤乳酸脱氢酶活力的影响

随着含沙量的升高，LDH酶活性总体趋势表现为：先缓慢降低后趋于平稳，在含沙量为0时，LDH酶活性最高；在含沙量为50%～100%时，酶活性低且数值波动小，相对稳定(图5)。含沙量对LDH酶活性有显著影响(P<0.05)；含沙量为0和25%时酶活性与其他3组差异显著(P<0.05)；50%、75%和100%的3组之间无显著差异(P>0.05)。

随着底质厚度的增加，LDH酶活性总体趋势表现为：先上升后趋于平稳。在底质厚度为3.0～6.0 cm时，LDH酶活性达到最高，且数值上下波动很小；在底质厚度为0 cm时，酶活性最低(图6)。底质厚度为0、1.5 cm的酶活性显著低于其他3组(P<0.05)，且两者之间无显著差异(P>0.05)；其他3组底质厚度3.0、4.5和6.0 cm之间无显著差异(P>0.05)。

图4 底质厚度对琥珀酸脱氢酶活性的影响Fig.4 Effect of different substrate thickness on SDH activity

图5 含沙量对乳酸脱氢酶活性的影响Fig.5 Effect of sand/mud ratio on LDH activity

图6 底质厚度对乳酸脱氢酶活性的影响Fig.6 The effect of different substrate thickness on LDH activity

3 讨论

3.1 不同底质对加州扁鸟蛤潜沙及存活的影响

加州扁鸟蛤有潜沙的习性，在潜进底质后通过露出的进出水管感知外界水流。实验中每隔12 h观察并记录加州扁鸟蛤的潜沙行为。含沙量对加州扁鸟蛤的潜沙率和存活率均有显著影响；含沙量为50%和75%时，潜沙率显著高于其他3组；各组之间的存活率均存在显著差异(P<0.05)。含沙量为50%～75%，潜沙率100%时，潜沙深度最深为5.6 cm。在含沙量为0和25%时，潜沙率较低，说明底质含泥量高影响潜沙行为。向含沙量25%实验组投喂螺旋藻液后，每隔5 h观察发现其摄食较其他几组慢，潜沙行为不活跃，存活率很低，仅为53.3%。含沙量为75%时，存活率最高达93.3%，实验组仅有一只死亡，说明此环境很适宜加州扁鸟蛤生存，潜沙行为和生理代谢水平均较高。

底质厚度对加州扁鸟蛤的潜沙率和存活率影响显著：厚度为4.5和6.0 cm时，潜沙率显著高于其他3组(P<0.05)；0、1.5和3.0 cm的存活率显著低于其他两组，且三者之间无显著差异(P>0.05)。可以看出底质厚度在3.0 cm以下时，加州扁鸟蛤基本无潜沙行为，个体不活跃；在4.5、6.0 cm时，潜沙率可达最高100%，潜沙最深为5.8 cm左右。投喂螺旋藻液后，每隔5 h看水色变淡的速度，厚度在4.5和6.0 cm时摄食情况较其他几组要好。而且底质厚度在4.5 cm时，存活率最高为93.3%，推断该条件是加州扁鸟蛤适宜的底质环境。

3.2 含沙量对加州扁鸟蛤呼吸代谢酶活力的影响

碱性磷酸酶(AKP)催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的分泌及形成均具有重要作用，是水产动物赖以生存、生长的重要酶类之一[20-21]。加州扁鸟蛤是埋栖型贝类，一般都埋栖在底质中，通过露出的进出水管进行新陈代谢，由此可见底质对其的重要性。不同底质对其存活率和生长都有影响，AKP酶活性整体随底质厚度的增加先升高后降低，由LSD多重比较可知：75%含沙量的酶活性显著高于其他4组(P<0.05)；底质厚度为0 cm时，酶活性显著低于4.5和6.0 cm时的AKP酶活性。在含沙量为0时，即底质全泥时AKP酶活性最低，代谢活动缓慢，能量代谢的磷酸化反应程度低；在0～50%范围酶活性升高不明显，可能是因为底质含泥量大，加州扁鸟蛤潜沙后活动量小，且机体代谢程度低，对外界物质的吸收利用率较低；而在含沙量为75%时，酶活性达到峰值，说明其对外界物质的吸收利用率也最高，以满足机体代谢的需求，观察发现投喂藻液后水色变淡的速度较快，表明其摄食速度比较快且生理状态最活跃。

SDH酶活性随含沙量的增加而不断升高后趋于平稳，由LSD多重比较可知：75%和100%含沙量时的酶活性显著高于其他3种条件(P<0.05)；0、25%和50% 3组之间存在有显著性差异。含沙量为0～25%底质含泥多，加州扁鸟蛤潜沙行为不活跃，生理活动不旺盛，氧化磷酸化反应程度低，故SDH酶活性较低；含沙量为50%～75%时，SDH酶活上升趋势明显，说明此阶段有氧代谢比较旺盛；含沙量超过75%时，酶活性达到峰值并趋于稳定，线粒体的呼吸作用加强，机体代谢旺盛，观察投喂螺旋藻液后水色变淡的速度较快，可知摄食情况良好，生理状态活跃。

LDH酶活性先是缓慢降低后趋于平稳，经LSD多重比较可知：含沙量为0和25%时酶活性与其他3组存在显著差异(P<0.05)；其余50%、75%和100% 3组之间无显著性差异。含沙量为0时，机体氧化磷酸化反应程度很低，而其无氧代谢变得旺盛以弥补ATP的不足，LDH酶活力最高；在含沙量为50%或100%时，酶活性低且数值波动很小。从整个过程观察到投喂螺旋藻液后，水色变淡的速度较慢，可知摄食速度较慢，潜沙行为不活跃，机体代谢水平保持在较低水平，加州扁鸟蛤生理活动较缓慢。在缺氧或者动物机体本身代谢过于旺盛但氧气供应不足的环境条件下，机体能量主要通过糖酵解作用供应，AKP对糖酵解有重要作用，研究已经发现其和能量代谢有关，SDH参与氧化磷酸化作用和三羧酸循环循环，SDH的活力可在一定程度上反应有氧代谢的水平[22]。乳酸脱氢酶与细胞代谢活动关系密切，是糖酵解与TCA循环之间的关键酶[23]，其活力可作为衡量无氧代谢水平的指标之一。

3.3 底质厚度对加州扁鸟蛤呼吸代谢酶活力的影响

AKP酶活性随底质厚度的增加而先升高后有所降低，根据LSD多重比较，底质厚度为3.0 cm时酶活性显著高于其他4组(P<0.05)，底质厚度为0 cm时，酶活性显著低于4.5和6.0 cm(P<0.05)。每隔12 h观察其潜沙率，底质厚度小于3.0 cm时，实验组加州扁鸟蛤基本不潜沙或达不到半数潜沙，在水中也基本不活动，机体代谢水平低。底质3.0 cm时，AKP酶活性最高，观察加州扁鸟蛤活动状况可知其喜好潜沙，生理状态最好；每隔5 h观察其摄食情况，发现底质在3.0和4.5 cm时，投喂螺旋藻液后水色变淡的速度较其他实验组快，表明此时加州扁鸟蛤摄食速度快，可能是由于底质厚度在适宜其潜沙的范围时，其摄食情况会相应变好。

SDH酶活性整体随底质厚度的增加先升高后趋于降低；经LSD多重比较可知：底质厚度为0和6.0 cm时，SDH的酶活性显著低于其他3组(P<0.05), 且两者之间无显著差异(P>0.05)；每隔12 h观察加州扁鸟蛤的潜沙率，底质厚度小于3.0 cm时，基本达不到半数潜沙，机体有氧代谢水平低。底质为3.0～4.5 cm时，SDH酶活性最高，有氧代谢最旺盛，摄食和生理状态较好。厚度达到6.0 cm时，潜底后有氧代谢速率稍有所降低，SDH酶活性有所下降。

LDH酶活性随底质厚度的增加，整体呈现先升高后趋于平稳趋势；经LSD多重比较可知：底质厚度为0和 1.5 cm时的酶活性显著低于其他3组，且两者之间无显著差异；其他3组(底质厚度为3.0、4.5、6.0 cm)之间无显著差异。在底质厚度为3.0～6.0 cm时，LDH酶活性达到最高，加州扁鸟蛤潜沙后，机体代谢活动主要依赖无氧呼吸产生的能量；在底质厚度为0和1.5 cm时，基本无潜沙行为，机体主要进行有氧代谢，LDH酶活性在此时较低。投喂螺旋藻液后，每隔5 h看水色变淡的速度，在底质厚度为0 cm时摄食速度最慢，其他实验组正常，可能底质厚度对其摄食和生理代谢有促进作用，使得加州扁鸟蛤潜沙后代谢水平相比没有底质时高。

4 结论

本实验中含沙量为75%时加州扁鸟蛤存活率最高，潜沙行为和生理代谢水平均较高。本实验中随着底质厚度的增加，AKP、LDH两种酶活性升高，底质厚度为3 cm时，AKP酶活性最高，在底质厚度为4.5 cm时，LDH酶活性最高，说明底质增加，加州扁鸟蛤潜底后，无氧代谢糖酵解反应旺盛；SDH在厚度3.0 cm时酶活性最高，说明加州扁鸟蛤不完全潜底时，有氧代谢比较旺盛，机体比较活跃。因此，在加州扁鸟蛤养殖过程中，保证在适宜的底质条件进行人工养殖是提高成活率的关键因素之一。本研究结果可为今后开展加州扁鸟蛤的人工养殖提供参考。