海洋生物多糖多肽联产制备技术的研究现状

杨大俏，王锦旭，李来好*，杨贤庆，马海霞

(1. 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广州 510300；2. 上海海洋大学食品学院，上海 201306)

海洋约占地球表面积的71%，含丰富的生物资源，近几十年来，渔业资源的产量不断增加[1]。世界水产品中，85%左右来源于海洋，2016年全球渔业捕捞量达到9.09×106t[2]，中国水产品产量约占世界水产品产量的1/3左右[3]。中国拥有丰富的海洋资源，但大多海产品是通过简单加工后直接进入食品市场，产品附加值不高，使得海产品产业发展受到影响。且被丢弃的鱼类加工副产品中含大量有效生物活性成分，其潜在应用价值亟待开发利用，因此，研究海洋生物及其副产物高值化利用的技术十分迫切[4-5]。

海洋生物多糖是指海洋生物中含有的多聚糖及酸性黏多糖，包括海藻多糖、海洋动物多糖和海洋微生物多糖，因其具有多种药用功能，已日渐成为研究热点[6]。海洋生物多肽是指海洋生物中固有的天然生物多肽，具有较高的稳定性，但对于海洋鱼虾贝类中的生物活性肽的研究仍处于起步阶段[7]。海洋生物通常含有较高的蛋白质及碳水化合物，脂肪含量较低，多作为多糖、多肽的可靠来源。海产品除了可作为药物的丰富来源[8]外，海洋天然产品已逐渐成为功能食品和膳食补充的主要来源之一。其中，海参(Thelenataanax)[9]、海星(Pentacerasterchinenesis)[10]、海胆(Hemicentrotuspulcherrimus)[11]、牡蛎(Crassostreagigas)[12]、合浦珠母贝(Pinctadamartensii)[13]、蓝圆鰺(Decapterusmaruadsi)[14]和海水螺旋藻(Spirulinaplatesis)[15]是较常见的富含营养活性成分的海洋生物。

对海洋生物活性成分提取分离的研究是当前热点课题之一[16]。目前关于海洋生物多糖或海洋生物多肽的提取工艺研究，多采用超声辅助水提取法[17]和蛋白酶水解法[18]，但该类研究多集中在单独提取多糖分子或单独提取多肽分子上，关于海洋生物多糖活性分子和多肽活性分子联产研究并未见报道。联产制备技术是指利用物理或化学方法同时提取物料中多种有效成分的高效生产技术[19-20]。关于多种物质同时提取或联产制备的研究，国内虽在油料作物[21]和中草药[22]活性成分的提取方面取得突破性成果，但海洋生物资源的高效利用工艺研究尚属空白。文章通过对海洋生物多糖及海洋生物多肽的活性成分及二者单独制备工艺进行梳理，并与陆生植物联产制备工艺比较分析，同时对联产制备海洋生物多糖及海洋生物多肽的研究现状进行总结，以期为海洋生物多糖和多肽的联产制备技术提供参考，为提高海洋生物资源利用率提供理论支持。

1 多糖多肽活性成分

海洋生物活性物质主要包括生物信息物质、海洋药用物质、海生毒素和生物功能材料，海洋生物活性代谢产物具有抗菌[23]、抗癌[24]、抗病毒[25]、抗肿瘤[26]和细胞毒素[27]等作用。迄今为止发现的生物医学应用的化合物包括生物碱、萜类化合物、类固醇、多肽、聚醚、大核素和多糖等[28]。研究生物活性物质是海洋研究的主导方向，其中对海洋多糖和多肽的研究历久弥新。

1.1 海洋生物多糖

多糖指聚合度超过10的多聚糖[29]，其分子量通常在数十万，最高可达百万，具有增强免疫力[30]、抗凝血[31]、降脂[32]、抗肿瘤[33]、抗氧化[34]、降胆固醇[26]和降糖[26]等功能。按其来源可分为动物多糖、植物多糖和微生物多糖。

1.1.1 海洋动物多糖

目前报道的海洋动物多糖主要包括甲壳动物、软体动物和棘皮动物等，甲壳动物多糖大多存在于其甲壳内，如虾、蟹等，具有降血脂、降血糖等功效[35-36]。研究发现，从海洋软体动物提取得到的糖胺类酸性多糖是一种新型海洋糖胺类多糖[37]，具有抗增殖功效；低分子量的牡蛎多糖可通过调节树突细胞增强机体免疫力[38]；水溶性的牡蛎多糖对高血压大鼠模型具有降血压功能[39]。分子结构分析结果表明，相对分子质量为1 299 KDa的太平洋牡蛎多糖为D-吡喃型葡聚糖[12]。棘皮动物如海参、海胆等，体内具有大量多糖，海参多糖[9]具有较强的体外抗肿瘤活性。虾夷马粪海胆(Strongylocentrotusintermedius)生殖腺多糖结构是由多聚甘露糖与糖原相连接而构成[40]。

1.1.2 海洋植物多糖

海洋植物多糖主要为海藻多糖，包括红藻门(Rhodophyta)、褐藻门(Phaeophyta)、蓝藻(Cyanobacteria)、绿藻门(Chlorophyta)和微藻门(Microalgae)。目前研究主要集中于红藻及褐藻多糖、卡拉胶和琼胶等物质。海藻多糖具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血糖和增强免疫力等功效。红藻糖苷通过抑制酪氨酸酶活性而具有抑制细胞生成黑色素的能力[41]；南非紫菜(Porphyracapensis)多糖能显著提高衰老小鼠脾脏和胸腺指数，并提高衰老小鼠的免疫机能[42]；小鼠腹腔注射海带(Laminariajaponica)多糖能激活其腹腔巨噬细胞，增强小鼠体内免疫调节[43]；海藻(Caulerpamexicana)中的硫酸化多糖对乙醇引起的胃损伤具有保护作用[44]；从海藻中提取出来的一种新型多糖化合物具刺激胰腺MIN-6细胞分泌胰岛素的功能[45]；海藻多糖则通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性而具降血糖功能[46]；南方团扇藻(Padinaaustralis)多糖对肝细胞细胞膜脂质氧化具有较高的抑制能力[47]。

1.1.3 海洋微生物多糖

目前关于海洋微生物多糖的研究较少，如Li等[34]从海洋真菌(Hansfordiasinuosae)中分离得到具有抗肿瘤特性的中性水溶多糖(HPA)。

1.2 海洋生物多肽

多肽[18]不同于多糖，其是氨基酸以肽键连接形成的化合物，分子量通常低于10 kDa，Mirzaei等[48]证实分子量小于3 kDa的多肽具有较高生物活性。多肽具有抗氧化[49]、抗菌[23]、抗肿瘤[50]、抗高血压[4]和抗病毒[25]等功效。因多肽具有来源丰富、易制备及结构鉴定简易等特点，已逐渐成为国内外研究热点，日本、美国和澳洲等地均有相应功能食品及保健品推出。

1.2.1 海洋动物多肽

已报道的海洋动物多肽涵盖各种高蛋白海洋动物，尤以海参[9]、海星[10]、海胆[11]、牡蛎[12]、合浦珠母贝[13]、蓝圆鰺[14]、金枪鱼(Thunnusobesus)[51]和罗非鱼(Oreochromisnioticus)[52]等海洋生物为代表，如提纯得到的分子量小于1 kDa的鱼蛋白水解物多肽，具有较高的抗高血压能力[4]；Je等[53]使用不同蛋白酶水解金枪鱼骨架蛋白以生产抗氧化多肽，并且研究了大眼金枪鱼[51]的黑肌肽在自由基介导的氧化系统中的纯化和抗氧化性质；牡蛎多肽[54]可显著抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长，6.4 kDa的太平洋牡蛎多肽[55]同样具有抗菌能力；You等[56]从合浦珠母贝中得到分子量约为11.6 kDa，含有95.1%蛋白质和含4.92%糖蛋白的珍珠肌蛋白(PMP)，并发现PMP具有明显的抗氧化能力；扇贝裙边活性肽则具降血糖功能，可以改善正常小鼠对血糖浓度的调节能力[57]。

1.2.2 海洋植物多肽

目前对于海洋植物多肽的研究主要集中于海藻藻胆蛋白的医学应用，而对海藻多肽的研究较少。研究发现，坛紫菜蛋白肽具有较好的降血压、降胆固醇和抗氧化作用[58]；紫菜多肽能有效控制高血脂大鼠体质量的增加，改善血脂水平，提高抗氧化酶活力，抑制脂质过氧化反应，降低患动脉硬化疾病的风险[59]；麒麟菜(Eucheuma)多肽对小鼠血栓起到抑制作用，具有预防血栓形成的潜在功能[60]；海带多肽则对小鼠急性辐射损伤具有防护作用[61]。

1.2.3 海洋微生物多肽

海洋微生物多肽作为水产动物免疫调节剂广泛应用于水产养殖中，具有促进鱼类生长，提高鱼类的非特异性免疫能力，降低死亡率[62]等功效。其中，口服微生物免疫多肽可提高黑鲷(Sparusmacrocephalus)[63]免疫力，并促进其生长。

综上，海洋多糖、多肽具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖和增强免疫力等多种药用功能，对海洋多糖、多肽的深入研究及应用将有益于人类健康水平的提高。

2 海洋生物多糖、多肽的单独提取工艺

多糖、多肽因结构特性不同，其提取制备工艺也有差异。多糖结构复杂、分子质量大，且由于海洋植物具有细胞壁结构，因此，海洋植物多糖高产制备的前提是破碎细胞壁，使内容物充分溶出；对海洋动物多糖而言，因其多与蛋白质结合，故而达到高产制备的前提是利用多糖大分子物质不溶于有机溶剂的特性，使其与蛋白质充分解离。多肽则具备结构简单、分子质量小的优势，选择蛋白质含量丰富的生物体且适当解离其蛋白质即可获得。

2.1 多糖提取工艺

目前常用的多糖提取方法为水提取法[64]，为提高其提取效率，通常辅助采用微波、超声波、高压、高温或加酸、加碱和加酶等手段，如酶提取法[9]、超声提取法[17]、微波辅助提取法[65]、超高压提取法[66]和膜分离技术[67]。近年来，酶提取法因其无毒、环境友好以及提取效率高的特性而被广泛使用。海洋生物多为高蛋白生物，其多糖与蛋白质连接复杂，故多采用碱提取法[68]和酶水解法[9]制备，以解离高分子蛋白质。粗多糖中往往混杂着游离蛋白质、多肽等，故单一制备海洋生物多糖时，多采用蛋白酶法[9]、Sevag 法[69]、等电点法[70]、三氟三氯乙烷法[71]和三氯乙酸沉淀法[72]去除蛋白，最后用乙醇等有机溶剂析出多糖大分子。如程婷婷等[73]以多糖得率为指标，用6种蛋白酶酶解鲍(Haliotisdiscushannai)脏器，并利用膜分离技术去除蛋白，最后用乙醇醇析制备多糖，发现碱性蛋白酶制备效果最佳。

2.2 多肽提取工艺

相比于多糖的提取工艺，多肽的提取工艺简单许多，按多肽的来源可以分为3类： 1)从自然界中的生物体中提取其本身固有的各种天然活性肽类[74]； 2)通过降解大分子蛋白质获得具备各种生理功能特性的活性肽[75]； 3)通过合成方法制备生物活性肽，包括化学合成法、酶合成法和重组DNA技术合成法[76]。其中，酶解蛋白质制备生物活性多肽的方式最为普遍[18]。如使用风味蛋白酶酶解金枪鱼肝脏[77]，得到具有活性肽的酶解液；利用菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶依次水解海地瓜(Acaudinamolpadioidea)的体壁蛋白质[78]，使用超滤膜将水解产物分为大于2 kDa和小于2 kDa的两部分；利用胰蛋白酶水解扇贝(Mimachlamysnobilis)肉[79]，得到2种分子量的抗氧化肽。国外研究人员普遍将重点放在酶解生物体蛋白质得到具有特定功能特性的活性肽上，并对其活性进行评价[55]。

3 陆生动植物生物活性物质的联产制备技术

国内对于从同一物料中同时提取2种及2种以上成分的研究大多集中在陆生植物原料上，以油料作物和中草药作物居多。而对于海洋生物，同时提取其内有效成分或多组分联产制备方法研究仍处于待开发阶段，国外在联产或同时提取方面的研究也不多见。

目前陆生植物联产技术主要集中于二次发酵[80]、酶解法[81]、超声辅助醇提法[82]、石油醚回流法[83]、碱提法[84]和碱溶酸提法[85]等方法，利用目标组分的极性、溶解性和挥发性等性质差异进行分离。如利用小麦酒精发酵的废液联产制备小麦多糖和活性肽，其发酵废液经过二段发酵后，取醇沉发酵后的上清液得到小麦多糖，酶解沉淀得到活性肽[80]。利用水酶法同时提取油茶籽油及蛋白质[81]，在最佳条件下，油茶籽油的得率可达到74.61%，蛋白质的得率为82.28%。孙月川等[86]从生地黄中同时提取地黄多糖和梓醇。还有研究者利用超声波辅助法同时提取了桑叶中的总黄酮和单宁，并利用正交试验优化得到最佳工艺[87]。马晓珂等[88]采用组合超声辅助提取技术同时提取葛根黄酮与葛根多糖，提高了葛根资源的综合开发效率和利用率。但以上方法特异性强，多应用于特定生物的特定组分联产提取，适用性不高。

4 海洋生物多糖、多肽联产制备技术研究现状

目前，海洋生物多糖和多肽的提取研究集中在单独提取多糖分子或单独提取多肽分子上，针对从一种海洋生物中同时提取活性多糖分子和多肽分子的研究甚少。海洋生物的多糖与多肽通常以糖链或肽链的方式连接于蛋白质分子或碳水化合物上，形成糖蛋白或糖胺聚糖，由于不同蛋白酶作用位点不同，海洋生物经过特定蛋白酶作用，可将糖复合物分解为糖链和肽链，或将蛋白质分解为肽段，选用合适的酶并在一定的添加量、料水比和作用时间条件下，使用合适的分离技术，即可得到具有特定生物活性及特定分子量的多糖分子以及多肽链。酶解工艺可有效地除去多糖产物中的蛋白质，并分解为所需的多肽产物，更为高效地利用生物资源。

多糖、多肽具有不同的理化性质，一般可以利用两者间的极性(溶解度)、电荷和分子量等差异进行分离，如水提醇沉法[89]、电泳[90]、季铵盐络合[91]、大孔树脂[92]、膜分离[67]、离子交换色谱[93]和液相色谱[93]等方法。水提醇沉法、季铵盐络合法操作简单，但试剂损耗大。柱色谱法(离子交换色谱、大孔树脂色谱等)是利用不同物质间体积大小、电荷、附着力和极性等特性的差异，造成其与固定相结合力不同，而被分别洗脱分离，但该方法耗时长，分离效率低[94]。高效液相色谱的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成分高效分离并进行定性及定量分析，适于分析不易挥发、分子量大及不同极性的有机化合物[95]，但是该方法对样品要求较高，且单次分离量低。膜分离中使用的膜是具有选择性分离功能的材料，以液体的压力差为动力，通过膜孔筛除作用进行分离，根据物料分子量差异，膜可实现选择性分离、纯化和浓缩，此过程是物理过程，期间无化学相变且无需添加化学助剂。膜分离方法相较于其他方法，因同时具有提取效率高、设备简单、低能耗、无污染和无相变的优点，而被广泛采用。

研究发现，2种不同超滤膜材料可分别得到不同的牡蛎多肽[96]，且超滤的温度、压力和pH等条件对超滤牡蛎多糖均有影响[67]，该研究为材料特性相似的海洋生物膜分离联产制备多糖多肽提供了理论依据。如陈发河等[97]通过选用不同截留分子量的超滤膜分离出4种海参多糖和3种海参多肽，研发了一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的联产制备方法。翁武银[98]利用复合酶解、膜分离、水提醇沉和离心分离等手段分离得到鲍多糖、脂质和蛋白肽，通过1个工艺流程同时得到3种物质。除此之外，国内外对海洋生物联产制备多糖多肽的研究未见报道。

5 小结

多糖、多肽因其独特的功能特性已逐渐成为研究热点，多糖、多肽提取技术都有了较成熟的工艺，但是针对多糖多肽联产制备工艺仍处于实验室阶段，导致目前对海洋资源的利用率不高。海洋生物资源丰富且具有高蛋白、高碳水化合物和低脂的特点，采用酶解-膜分离工艺能更好地同时制备海洋生物多糖及多肽，但国内研究多处于实验室阶段，国外对海洋生物资源高值化利用的研究也较少。关于多种物质同时提取或联产的研究，国内主要集中于油料作物和中草药活性成分的提取研究，针对更高效地利用海洋生物资源的工艺研究还较少；国外研究在这一方面几乎还是空白，尤其是对于高蛋白海洋生物而言，其多糖多肽联产工艺还未引起广泛关注。因此，重视对海洋生物多糖多肽联产制备技术的研究，可为有效利用海洋资源和鱼类加工副产物提供理论技术支持，海洋生物资源的高值化利用及工业化生产将有助于为医药、功能辅助食品、保健品等行业的发展拓展更广阔的空间。