谷氨酸受体1与钩藤碱抑制甲基苯丙胺依赖斑马鱼条件性位置偏爱的关系

朱 晨，刘 伟，李 璟，陈志杰，李 婵，周玉婷，莫志贤

(南方医科大学1. 中医药学院中药药理学教研室、2. 中心实验室，广东 广州 510515)

钩藤碱是常用中药钩藤的主要活性成分，长期用于治疗中枢神经系统疾病，如高血压、头痛、中风等[1]。本团队前期研究发现，钩藤碱可以通过减少酪氨酸羟化酶的表达来抑制甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)依赖小鼠产生条件性位置偏爱(conditioned place-preference，CPP)[2]。谷氨酸受体1(glutamate receptor 1，GluR1)是中枢兴奋性氨基酸受体，主要分布于突触前。GluR1是α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异 唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)受体的关键亚型之一，与相应的配体结合后可产生兴奋作用[3]。本研究利用斑马鱼作为动物模型，联合应用行为学、免疫组化、Western blot等方法，研究中药有效成分钩藤碱对METH诱导斑马鱼CPP效应的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂盐酸甲基苯丙胺(国家麻醉品实验室，批号：1212-9802)；钩藤碱(日本MATSUURA YKUGYO公司)；盐酸氯胺酮注射液(规格：2 mL ∶0.1 g，江苏恒瑞医药股份有限公司)；3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(JL160318010，江莱生物公司); 抗GluR1抗体(MAB397，Millipore公司)；鱼用生理盐水，自配，NaCl浓度为100 mmol·L-1。

1.2 仪器Noldus EthoVision XT 8.5软件(荷兰Noldus公司)；ChemiImager 550凝胶成像仪(美国Alpha Innotech公司); Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国 Media Cybernetics公司)。

1.3 实验动物斑马鱼(野生型，AB系，6～10个月)，♀♂各半，由南方医科大学斑马鱼实验中心提供。养鱼系统为北京爱生公司净水系统(水温28.5 ℃)；鱼用盐水浓度为0.03%～0.04%；pH值为7.2～7.6；光照条件为14 h光照(8 ∶30 am-10 ∶30 pm)，10 h黑夜(10 ∶30 pm-8 ∶30 am)。

2 方法

2.1 CPP箱的制作斑马鱼CPP箱为长16 cm、宽9 cm、高9 cm的鱼缸，鱼缸中间插入透明活动挡板将其分隔成两个箱体，其中一箱体涂成黑色，另一箱体涂成白色。抽开透明挡板时，斑马鱼可在两箱体间自由活动。

2.2 斑马鱼基线测定斑马鱼适应性喂养2 d后进行基线测定。实验前，将CPP箱中间的挡板抽开，当斑马鱼进入箱中时开始计时，记录斑马鱼15 min内在两箱体的停留时间(以头部为准)。结果表明，≥95%的斑马鱼天性偏爱黑箱，因此，以在黑箱中的活动时间>8 min为合格，剔除对白箱有明显偏爱的斑马鱼。

2.3 CPP模型的复制与给药将筛选合格的斑马鱼随机分成5组：对照组、模型组、钩藤碱低剂量组(50 mg·kg-1)、钩藤碱高剂量组(100 mg·kg-1)、氯胺酮组(150 mg·kg-1)。实验前,记录斑马鱼在CPP箱中15 min内的活动。d 1、3、5，除对照组外，其余组斑马鱼8 ∶00 am腹腔注射METH 40 mg·kg-1(对照组注射等体积生理盐水)，之后放入白箱中训练45 min；d 2、4，同一时间全部组斑马鱼腹腔注射同体积生理盐水，之后放入黑箱中训练45 min。d 1～5，给药组斑马鱼8 ∶00 pm腹腔注射相应药物(对照组和模型组则注射等体积生理盐水)。d 6，记录各组斑马鱼在CPP箱中15 min内的活动。

2.4 免疫组化法检测斑马鱼脑GluR1的表达斑马鱼行为学测定结束后，将其冷冻处死，剪下头部，4%多聚甲醛固定24 h。头部修剪整齐，进行梯度脱水和石蜡包埋。切片机切片，厚度约5 μm，用防脱载玻片捞起后烤干，进行常规脱蜡和水化。组织切片用PBS缓冲液冲洗后，用3% H2O2内源常温下封闭10 min后，进行抗原修复。再次清洗之后，滴加5%正常小牛血清常温封闭20 min。随后加入一抗GluR1(1 ∶100)，4 ℃过夜;PBS漂洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，常温 1 h；阴性对照用PBS液代替一抗。

2.5 Western blot检测GluR1的表达斑马鱼行为学测定结束后，斑马鱼冷冻处死，显微镜下取出斑马鱼的脑组织，用RIPA裂解液和PMSF(50 ∶1)提取脑组织蛋白，SDS-PAGE电泳，转膜，用牛奶常温封闭2 h，1×TBST清洗3次后，加入稀释好的一抗GluR1(1 ∶100)，4 ℃过夜；1×TBST清洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)，常温1 h。洗去二抗，加入发光液，用凝胶成像仪获取条带图像，以β-actin为内参，用Image-Pro Plus 6.0软件分析条带。

3 结果

3.1 钩藤碱对METH依赖斑马鱼行为学的影响用Noldus EthoVision XT8.5软件分析斑马鱼训练前后在白箱中的逗留时间差及活动轨迹(斑马鱼训练前后在白箱中逗留时间的差值=斑马鱼训练后在白箱中的停留时间-斑马鱼训练前在白箱中的逗留时间)。如Fig 1所示，与对照组相比，腹腔注射METH 40 mg·kg-1后，模型组斑马鱼在白箱中停留时间明显增加(P<0.01)；与模型组相比，钩藤碱高剂量组斑马鱼在白箱中的停留时间明显减少(P<0.01)。各组斑马鱼造模前后在CPP箱的活动轨迹图见Fig 2。

3.2 钩藤碱对METH依赖斑马鱼脑内GluR1阳性细胞数的影响采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，测定各组斑马鱼脑内GluR1阳性细胞的IOD值，每组各项指标的相对含量以平均值表示。如Fig 3所示，与对照组相比，模型组斑马鱼脑内GluR1阳性细胞数明显上调(P<0.01)；与模型组相比，钩藤碱低、高剂量组斑马鱼脑内GluR1阳性细胞数明显下调(P<0.01)。

Fig 1 Change of activity time of zebrafish

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

Fig 2 Road maps of zebrafish in CPP compartment before and after CPP train

Fig 3 Micrographs of GluR1 positive cells

A: Micrographs of GluR1 positive cells in zebrafish brain; B: The IOD of GluR1 positive cells in zebrafish brain in each group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

3.3 钩藤碱对METH依赖斑马鱼脑内GluR1蛋白表达的影响如Fig 4所示，各组斑马鱼脑内GluR1蛋白的表达差异具有显著性。与对照组相比，模型组斑马鱼脑内GluR1表达明显上调(P<0.01)；与模型组相比，钩藤碱低、高剂量组斑马鱼脑内的GluR1表达明显下调(P<0.01)。

4 讨论

全球约有3 000多万人使用安非他明类兴奋剂，METH是最常见的安非他明类兴奋剂之一，使用率约占71%。METH是一种具有强烈的中枢兴奋作用的药物，长期使用后会造成机体多器官损伤、精神障碍等。

斑马鱼和人类的早期发育极为相似。在基因水平上，斑马鱼与人之间的血液系统、内脏器官、视觉系统、中枢神经系统具有85%的同一性。凭借其良好的繁殖能力、透明胚胎、生长速度和人类基因之间的相似性，斑马鱼受到越来越多生物学家的青睐。

Fig 4 GluR1 expression of zebrafish by Western

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

一些研究人员成功地建立了斑马鱼药物依赖CPP模型，斑马鱼在成瘾医学领域的应用被证明是可行的。Cachat等[4]建立了咖啡因、酒精、吗啡和地西泮的斑马鱼成瘾戒断模型，并指出这些物质可以影响斑马鱼的行为和内分泌，证实斑马鱼可能成为药物依赖性研究的模型。Ninkovic等[5]的研究表明，腹腔注射D-苯丙胺可以改变成年斑马鱼的位置偏好行为。

在本研究中，CPP测试的结果显示，与对照组相比，模型组斑马鱼在白箱中的停留时间明显增加；而在给予氯胺酮和钩藤碱干预后，与模型组相比，斑马鱼在白箱中的停留时间明显减少。这表明METH(40 mg·kg-1)可以诱导斑马鱼产生CPP效应，氯胺酮(150 mg·kg-1)和钩藤碱(100 mg·kg-1)可以逆转该作用。

大量研究发现，AMPA受体亚基GluR1与药物成瘾密切相关。急性全身注射可卡因和METH，或者伏隔核局部注射安非他明可以引起GluR1含量的增加[6-7]。腹腔注射苯丙胺可以导致大鼠的前额皮质和纹状体神经元活动的变化，并且引起前额皮质中GluA1磷酸化(pS845)的改变[8]。METH能够诱导中枢神经系统中谷氨酸水平的升高，而脑内GluR1水平的升高会加速药物依赖的形成[3]。

在本研究中，与对照组相比，模型组斑马鱼脑内GluR1的表达明显增强，表明斑马鱼对METH依赖的形成可能与GluR1的表达增加有关。与模型组相比，氯胺酮(150 mg·kg-1)组和钩藤碱(50、100 mg·kg-1)组斑马鱼脑GluR1表达明显降低，此生物学结果和行为学结果基本一致。这些结果表明，GluR1可能参与药物(METH)依赖性形成。现代研究表明，钩藤对中枢神经系统具有镇静、抗癫痫、抗惊厥和对神经元的保护作用等。本团队早期研究发现，钩藤碱能明显拮抗苯丙胺依赖大鼠产生CPP的效应，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基蛋白表达上调，使METH依赖性大鼠脑内的GluR2/3表达正常化[9-11]。

综上所述，钩藤碱能抑制斑马鱼产生METH依赖，其机制可能与抑制斑马鱼脑内GluR1表达有关。然而，由于中药的复杂机制，药物依赖和GluR1的机制仍有待探索。