精子DNA碎片化指数与体外受精-胚胎移植结局的关系

李天赋，夏西洋，卫海，高亭亭，龙伟，周文柏，陈莉

（南京医科大学附属常州妇幼保健院1.生殖医学中心，2.中心实验室，江苏 常州213003）

据WHO统计，全球约有6 000万人无法生育，占育龄人口的15%左右，其中约45%是由男性因素造成［1］。随着辅助生育技术的发展，对男性不育的认识也逐渐加深，传统的精液分析已不能满足临床需求，更多评估男性生育力的指标得到专家的重视。精子作为遗传信息的载体，其完整性对生育后代具有重要意义，精子DNA损伤作为一个反映精子质量的新指标，逐渐应用于临床［2］。精子DNA损伤是精子染色质结构异常的一个重要特征，是造成男性不育、复发性自然流产以及辅助生殖技术治疗失败的重要原因之一［3-4］。本研究拟通过测定精子DNA碎片化指数（DNA fragmentation index，DFI），分析精子DNA损伤对体外受精 胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）结局的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年3月至2018年3月在常州市妇幼保健院生殖中心就诊夫妇为研究对象。女方入组条件：①年龄≤35周岁；②确诊为输卵管因素导致不孕；③无其他妇科疾病；④其他各项常规检查无异常（如性激素6项、子宫附件B超、免疫抗体指标、病原体感染指标等）。男方入组条件：①年龄≤38周岁；②精液常规检查无明显异常；③排除梗阻性无精子症、Y染色体微缺失、生殖系统感染等疾病。所有研究对象夫妻双方染色体核型检测均正常，且均为首次进行IVF-ET治疗。

1.2 标本收集与处理

要求男方禁欲3～7 d后在医院取精室通过手淫方法留取精液。置于室温液化，记录精液体积，取部分液化后精液做精液常规、形态及精子DFI检测。常规取2 mL充分液化精液采用ISOLATE梯度液（美国IrvineScientific公司）进行密度梯度离心法处理：吸取1 mL上层离心液加入离心管底部，然后吸取1 mL下层离心液缓慢加于上层离心液之上。吸取液化后的精液缓慢加于最上层，每一步骤注意界面清晰。放入离心机以475×g离心15 min后，吸取底部的白色沉淀加入3 mL配子培养液（G-IVF PLUS，Vitrolife公司）中混合均匀，再以370×g离心9 min，弃上清液，留0.5 mL沉淀混匀，延管壁缓慢加入适量配子培养液，进一步使用上游法优选精子。

1.3 精子DNA损伤检测

采用流式细胞仪和精子核完整性染色试剂盒（浙江星博生物科技公司），通过精子染色质结构分析试验（SCSA）进行DFI检测。①平衡样品线：于流式细胞仪的样品管中加入400μL的B液和1.2 mL C液混合成平衡缓冲液，上样，使其在流式细胞仪的样品线运行15 min，以确保染色液与进样管相平衡。②显微镜下观察精子并计数。③根据计数的精子浓度，取一定量精子用A液稀释至100μL，终浓度为（1～2）×106个／mL的精子细胞。④在流式细胞仪的进样管中加入100μL上述稀释好的样本。⑤加入200μL的B液（细胞置于冰上操作），准确计时30 s之后，加入600μL C液。⑥将已经染好色的样品加入样品室，立即启动样品流。⑦检测精子的流动速度2 min后开始收集数据，至少有5 000个细胞的测定值加以记录和统计。

精子核经过酸处理液处理后，再经吖啶橙染色。异常精子核染色质为单链，与吖啶橙结合发橙黄色或红色荧光；正常精子核染色质为双链，与吖啶橙结合发绿色荧光。若红光（值）比例增高，说明精子核完整性程度降低。利用统计软件计算DFI值［红色荧光／（红色荧光+绿色荧光）］。以DFI值＜15%、15%～30%、＞30%将患者分成正常组、低损伤组、高损伤组。

1.4 女方IVF方案

从月经周期的第21天（排卵后1周或者服用避孕药后19天）开始注射短效醋酸曲普瑞林（达必佳），给药后第14-16天开始加用促性腺激素药物（果纳芬）进行促排卵，整个促排卵过程需要9～12 d，直到卵泡成熟，然后注射人绒毛膜促性腺激素（hCG），36～38 h后取卵。

1.5 胚胎实验室和临床结局观察指标

统计获卵数，于取卵后当天进行体外受精，16～18 h后观察受精情况，见到两个原核细胞为正常受精，受精率＝受精数／获卵数；体外受精后第3天观察胚胎卵裂情况，计算卵裂率＝卵裂数／受精数。统计优质胚胎数，得到优胎率＝优质胚胎数／卵裂数。受精后第5天观察囊胚情况，统计囊胚形成率＝可用囊胚数／卵裂数。本研究所有入组方案，均进行冻胚移植，移植第35天，进行B超检查确定是否妊娠，妊娠率＝妊娠数／每组人数，追踪病例至妊娠结束，统计流产率＝流产数／妊娠数。

1.6 统计学分析

应用SPSS22.0软件进行统计学分析，3组计量资料符合正态分布，以±s表示，3组间获卵数、正常受精率、卵裂率、优胎率、囊胚形成率比较均选用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；妊娠率、流产率比较采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较

共收集158对患者，根据纳入标准，并力争减少组间差异，最终纳入90对病例。3组之间男女双方年龄、男方精液常规指标、女方获卵数无明显差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 胚胎实验室指标与临床结局比较

3组间受精率、卵裂率均无明显统计学差异（P＞0.05）；与正常组相比，高损伤组的优胎率和囊胚形成率明显降低（P＜0.05），低损伤组的囊胚形成率明显降低（P＜0.05）。移植第35天B超及回访追踪妊娠结局显示，与正常组相比，高损伤组的妊娠率明显降低（χ2＝4.356，P＜0.05）；而3组间的流产率则无明显差异（χ2＝0.078，P＞0.05）。见表2、表3。

表1 3组患者一般情况比较

表2 3组实验室观察指标比较

表3 3组临床结局指标比较

3 讨论

精子DNA承载了男性的遗传物质，其染色质结构关系到精子的受精能力、胚胎发育情况以及临床妊娠能否顺利进行［5］。精子DNA损伤导致的精子染色质结构异常，是引起男性不育、辅助生殖治疗失败、反复流产的重要原因。造成精子DNA损伤的因素很多，各种原因导致的精子形成过程中的细胞凋亡、氧自由基产生、氧化应激反应以及染色质包装异常等［6-8］，都可能影响精子DNA的完整性。另外，环境污染、全身其他系统疾病、生活方式、药物使用等也会引起精子DNA的损伤［9］。

目前检测精子DFI的实验方法很多，主要包括：末端转移酶介导的dUTP末端标记法（TUNEL）、精子染色体扩散实验（SCD）、精子染色质结构分析试验（SCSA）、单细胞凝胶电泳（SCGE）、荧光原位杂交技术（FISH）、基因芯片技术等。SCD法方便快捷，但受实验人员主观操作影响较大，且无法评估受损程度；TUNEL法敏感性高，结果准确，但操作复杂，成本较高且缺乏临床标准化流程；SCSA具有较高敏感性和可重复性，各临床中心目前大多使用此法，但最近有学者指出该方法存在设门随意、计算方法有误等问题［10］。本研究使用的是目前各大生殖中心普遍采用的SCSA法，该方法检测方便、检测结果可以被其他中心认可，目前仍是精子DFI检测的首选方法。

一项荟萃分析指出，检测精子DNA损伤的方法与受精率、卵裂率等实验室指标无明显相关［11］。有学者发现，精子DNA损伤与男性生育能力呈负相关性，影响自然生育能力，但与受精率、妊娠率无明显相关性［12-13］；同时有多项研究表明，DFI与受精能力、胚胎发育、临床妊娠结局以及辅助生殖技术治疗效果呈显著相关［14-15］。正常精子率作为男性精液检查一项重要项目，与DFI的关系也存在争议［6，16-17］。本研究发现，与正常组相比，低损伤组和高损伤组的精液浓度、前向运动能力、正常精子率均无明显差异。同时，3组间的受精率、卵裂率也无统计学差异，原因可能与胚胎发育初期主要受卵子DNA调控有关［18］。而优胎率、囊胚形成率、妊娠率这几项指标，高损伤组明显低于正常组，说明父源性DNA在胚胎发育过程中逐渐开始发生作用，并最终影响了临床结局。本研究中3组的流产率无明显差异，可能与每组流产数过低有关。

综上所述，精子DNA损伤指标DFI对临床判断男性生育能力、预判辅助生育结局具有一定的指导意义，因此建议各医院男科以及生殖中心开展此类检查。同时期待有更标准化的DFI检测技术流程，以降低检测过程中人为因素造成的DFI偏差所带来的临床不良结局。