shRNA稳定干扰Raptor基因表达的小鼠胸腺上皮细胞系的建立

闵玉娇，吴皓杰，王荟，潘子辉，邵启祥

（1.江苏大学医学院免疫学与免疫学检验教研室，江苏 镇江212013；2.江苏大学生殖医学科学研究院，江苏 镇江212001）

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号途径是普遍存在于细胞中的一条重要信号途径，可调节细胞周期进程、细胞增殖和代谢［1-2］。mTOR 激酶分为雷帕霉素敏感的mTORC1和雷帕霉素不敏感的mTORC2。mTOR和mLST8均存在于两种mTOR激酶中，此外mTORC1中还包含Raptor、PRAS40等分子。研究表明，mTORC1在个体、组织和细胞的生长发育和退化中发挥重要作用［3］。mTORC1与T细胞的发育分化关系密切，胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells，TECs）作为构成胸腺微环境的重要组分对T细胞的发育有很大影响。本课题组前期研究发现mTORC1可能参与TECs的退化过程（未发表），本研究拟通过构建Raptor shRNA慢病毒载体稳定转染小鼠胸腺上皮细胞系（mouse thymic epithelial cell line 1，mTEC1），敲降Raptor基因，观察mTORC1在TECs中的作用，从而阐明TECs衰老和退化机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

慢病毒载体质粒pLKO.1-puro由上海交通大学医学院、上海市免疫学研究所李斌教授惠赠；ps-PAX2及PMD2.0G慢病毒包装质粒为我院龚爱华教授赠予；感受态DH5α细菌由本实验室杜凤移老师馈赠；限制性内切酶AgeⅠ和Eco RⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒为生工生物工程（上海）股份有限公司产品；DMEM培养液、胎牛血清和Lip2000为美国Thermo公司产品；牛血清白蛋白购自湖州英创生物科技有限公司；哺乳动物蛋白抽提试剂RIPA购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白酶抑制剂混合物为瑞士Roche公司产品；抗磷酸化mTOR（phosphomTOR，p-mTOR）、抗mTOR、抗Raptor、抗磷酸化核糖体S6激酶（phospho-p70S6k，p-p70S6k）、抗核糖体S6激酶总蛋白（t-p70S6k）和HRP偶联的羊抗兔IgG抗体均为美国CST公司产品；抗β-肌动蛋白抗体为美国Santa Cruz公司产品；ECL检测试剂盒为德国Merck公司产品。

1.2 细胞培养

1.3 Raptor基因shRNA目的片段的合成

从Sigma网站检索Raptor基因的shRNA序列，并在其5′端和3′端分别加入AgeⅠ和Eco RⅠ限制性核酸酶切位点序列，具体序列如下：正义链，5′-CCGGGCCCGAGTCTGTGAATGTAATCTCGAGATT ACATTCACAGACTCGGGCTTTTTG-3′；反义链，5′-A ATTCAAAAAGCCCGAGTCTGTGAATGTAATCTCGA GATTACATTCACAGACTCGGG-3′；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 pLKO.1-puro慢病毒载体质粒酶切

慢病毒载体质粒pLKO.1-puro经感受态DH5α细菌扩增后，用限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ进行酶切，体系如下：AgeⅠ2.5μL，Eco RⅠ2.5μL，pLKO.1-puro 2.5μg，缓冲液5μL，以无菌双蒸水补足至50μL。酶切反应条件：37℃4 h。

1.5 胶回收酶切后pLKO.1-puro载体

将“1.4”产物行1%琼脂糖凝胶电泳，并于长波紫外检测仪中检测，切取目的位置相应的条带并称重。按照生工生物工程（上海）股份有限公司胶回收试剂盒操作步骤进行胶回收。

1.6 载体酶切及与目的片段的连接

将Raptor基因shRNA目的片段的正义链与反义链1∶1混合，退火后按下述体系加样，16℃连接过夜，将shRNA连接到胶回收的pLKO.1-puro载体中。体系如下：10×缓冲液2μL，pLKO.1-puro酶切纯化载体1μL，Raptor shRNA目的片段16μL，T4连接酶1μL。

1.7 pLKO.1-puro-shRNA-Raptor转化感受态细菌

取“1.6”中连接产物1μL加入感受态DH5α中，轻轻混匀置于冰上孵育30 min；42℃孵育90 s，期间勿摇动EP管；休克结束后迅速移至冰上，加入LB液体培养基400μL，于37℃摇床250 r／min扩增2 h；4 000 r／min室温离心4 min，弃去一半上清液后混匀，将菌液均匀涂布于含有氨苄西林的LB固体平板上，37℃培养16 h；然后挑取单个菌落接种于含有氨苄西林的LB液体培养基中，于37℃摇床250 r／min孵育过夜。

1.8 质粒的提取和测序

按照试剂盒说明书提取质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，分析shRNA序列（含AgeⅠ和Eco RⅠ两个酶切位点）是否正确，确认是否成功构建pLKO.1-puro-shRNA-Raptor载体。

1.9 病毒的包装与感染

将HEK-293T细胞接种于60 mm培养皿中，当细胞生长至汇合度为70%且状态良好时，加入6μg质粒进行转导，即pMD2G、psPAX2和pLKO.1-puroshRNA-Raptor载体按质量比1∶2∶3比例混匀，加入高糖DMEM至250 mL；同时另取高糖DMEM 232 mL，加入18μL Lip2000混匀，室温静置5 min；最后将含有质粒的DMEM 加入至含有Lip 2000的DMEM中，混匀，室温静置20 min；加入到HEK-293T细胞培养皿中，补充培养基体系至3 mL，置于37℃，5% CO2培养箱培养8 h；弃培养液，加入3 mL含10%胎牛血清的无双抗高糖DMEM继续培养24 h；收集培养上清液，用0.22μm除菌滤器过滤，即为病毒悬液；同时将转染的HEK-293T细胞更换新鲜培养基孵育24 h，再次收获病毒悬液。将收获的病毒悬液和含10%胎牛血清的DMEM以1∶1加入到汇合度为30%左右的mTEC1中，加入聚凝胺（5μg／mL）培养24 h；重复此步骤再次培养24 h后更换正常的无双抗DMEM并加入嘌呤霉素（2～5 μg／mL）筛选稳定感染的细胞。待细胞生长稳定，完全抵抗嘌呤霉素后，收集部分细胞提取蛋白进行免疫印迹法鉴定，另一部分继续传代培养。

1.10 免疫印迹法检测各组细胞相关蛋白的表达

将野生型mTEC1和稳定感染shRNA-Raptor病毒的mTEC1以每孔2×105接种于6孔板，前者接种2孔，后者接种1孔，37℃5% CO2培养24 h，分别记作mTEC1组，shRNA-Raptor组。在其中1孔野生型mTEC1中以1∶1 000加入50μmol／L雷帕霉素，记作mTEC1-雷帕霉素组。继续培养12 h，收集各组细胞提取蛋白；mTEC1-雷帕霉素组作为mTOR及其下游被抑制的阳性对照。

蛋白行SDS-PAGE，70 V 2 h；350 mA转膜2 h；PVDF膜洗涤后用5% BSA封闭1 h；抗Raptor、mTOR、p-mTOR、p70S6k、p-p70S6k和内参β-肌动蛋白等一抗按说明书用封闭液按1∶1 000稀释，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP偶联的羊抗兔IgG抗体（TBST稀释，均为1∶10 000），室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；采用ECL检测试剂盒曝光检测各蛋白表达情况并进行灰度扫描，使用Graph-Pad Prism 5软件进行统计学分析。

1.11 连续计数法检测mTEC1-shRNA-Raptor细胞的增殖

将野生型mTEC1与稳定感染shRNA-Raptor病毒的mTEC1以每孔5 000个细胞的初始密度接种于12孔板，各接种7个复孔。每天各计数两种细胞其中一个孔的细胞数，计数7 d；重复3次。

1.12 TUNEL法检测mTEC1-shRNA-Raptor细胞的凋亡

将野生型mTEC1与稳定感染shRNA-Raptor病毒的mTEC1以5 000个／孔接种于96孔板，5% CO237℃培养48 h，根据罗氏公司Tunel试剂盒说明书染色。主要步骤如下：弃去96孔板中培养基，PBS洗2次；每孔加100μL 4%低聚甲醛（pH＝7.4），室温固定20 min；PBS洗2次；加入新鲜配制的渗透液100μL置于冰上破膜10 min；PBS洗涤2次；将标记溶液与酶浓缩液以9∶1比例混合，每孔加入50 μL，37℃孵育1 h；PBS洗涤2次，滴加1滴PBS置于荧光显微镜下观察，阳性细胞可见绿色荧光。最后计算出阳性细胞比例。

1.13 统计学方法

所有实验数据采用GraphPad Prism 5软件行统计学分析，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，3组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；2组间均数比较采用t检验，以P＜0.05判断差异有统计学意义。

2 结果

2.1 载体质粒pLKO.1-puro酶切和电泳鉴定

pLKO.1-puro慢病毒载体经酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示在1 900 bp和7 000 bp左右处出现条带，表明载体质粒酶切成功。见图1。

2.2 Raptor shRNA目的片段与载体连接产物的鉴定

测序结果与插入的Raptor基因的shRNA序列5′-CCGGGCCCGAGTCTGTGAATGTAAT-CTCGAGATTACATTCACAGACTCGGGCTTTTTG-3′完全一致（第261～318位），表明成功构建pLKO.1-puro-shRNARaptor载体。见图2。

2.3 pLKO.1-puro-shRNA-Raptor稳定转染mTEC1细胞系的建立

由图3可见，与mTEC1组相比，shRNA-Raptor组Raptor蛋白、p-mTOR以及p-p70S6k表达量均明显降低（P均＜0.05）；与mTEC1组相比，mTEC1-雷帕霉素组p-mTOR以及p-p70S6k表达量也明显降低，但二者间Raptor蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。由此进一步说明，shRNA-Raptor组pmTOR以及p-p70S6k表达降低是由Raptor基因抑制造成的。

图1 p LKO.1-puro载体酶切电泳鉴定

图2 pLKO.1-puro-shRNA-Raptor载体鉴定

图3 免疫印迹检测各组细胞相关蛋白的表达

2.4 mTEC1-shRNA-Raptor和野生型mTEC1细胞数变化

如图4所示，mTEC1-shRNA-Raptor和mTEC1培养7 d，2种细胞同一天的细胞数间差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

图4 mTEC1-shRNA-Raptor和mTEC1细胞计数

2.5 Tunel细胞凋亡试验阳性率统计

如图5所示，mTEC1-shRNA-Raptor和野生型mTEC1细胞Tunel试验阳性率均很低，二者差异无统计学意义（t＝1.27，P＞0.05），表明2种细胞正常培养时很少发生凋亡。由此说明，Raptor基因敲降并不引起mTEC1明显的凋亡。

3 讨论

图5 mTEC1与mTEC1-shRNA-Raptor细胞Tunel试验阳性率比较

自噬是细胞清除其损伤的细胞器或错误折叠蛋白的重要方式。自噬减弱时，细胞内错误折叠的蛋白堆积，导致细胞衰老死亡。mTOR信号通路是细胞内重要的信号通路，其可抑制自噬［4］。大量文献报道，mTOR活化增加可致细胞衰老和退化［5-9］。胸腺是机体最重要的中枢免疫器官，TECs是胸腺中最为重要的基质细胞之一，是胸腺微环境的重要组成部分。本实验室研究发现，随着小鼠年龄的增长，胸腺mTOR表达上调（未发表）。为进一步研究mTOR在TECs退化中的作用，本研究通过建立mTORC1与下游作用的重要分子Raptor基因稳定敲降的mTEC1细胞，成功构建Raptor基因的pLKO.1-puro-shRNA慢病毒质粒，并成功感染mTEC1。免疫印迹结果表明，转染后的mTEC1-shRNA-Raptor细胞Raptor和p-mTOR以及p-p70S6k蛋白表达水平明显降低，说明已成功构建Raptor基因敲降的mTEC1细胞系。mTOR参与细胞的增殖和凋亡，本实验采用连续计数法以及Tunel法检测细胞增殖与凋亡，结果显示，Raptor基因的敲降并不影响mTEC1增殖和凋亡。Foxn1是转录叉头因子家族成员，在胸腺发育中起重要作用。已有文献报道，敲除mTORC1／Raptor并不会引起胸腺的明显萎缩和胸腺细胞的凋亡，只有联合敲除Foxn1后，胸腺才发生明显的退化和萎缩［10］。本实验结果也证明这一点。尽管mTORC1信号通路参与细胞的生长增殖，但其对mTEC1的作用还未阐明，在胸腺退化过程中mTOR信号和Foxn1之间以何种方式发挥作用，尚有待深入研究。