低氧诱导胰腺癌细胞通过外泌体途径分泌高迁移率族蛋白1

王鸣，宋廉，张礼荣，龚爱华，朱海涛，王冬青

（1.江苏大学医学院，江苏 镇江212013；2.江苏大学附属医院影像科，江苏 镇江212001）

研究表明，低氧微环境及其诱导产生的各种炎症因子在胰腺癌恶性生物学行为中起重要作用［1-2］。高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是高度保守的核内非组蛋白，可从活化的免疫细胞中主动释放，或者从受损、应激及坏死的细胞释放［3-4］。研究表明，低氧可促进HMGB1被动释放［5］。然而低氧环境下HMGB1的释放途径仍不明确，故本实验以人胰腺癌细胞系PaTu8988为研究对象，探讨低氧条件下肿瘤细胞释放HMBG1的途径。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人胰腺癌PaTu8988细胞株购自中科院上海细胞研究所；DMEM高糖培养基，PBS（美国Hyclone公司）；澳洲胎牛血清（美国Gibco公司）；兔抗人单抗隆抗体低氧诱导因子-1（HIF-1α，美国Cell Signaling Technology公司）；兔抗人单克隆抗体β-微管蛋白、HSP70，兔抗人多克隆抗体HMGB1（英国Abcam公司）；鼠抗人单克隆抗体CD9、CD63、CD81，羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；Cy3标记山羊抗兔IgG，FITC标记山羊抗小鼠IgG（碧云天生物科技公司）；超滤离心管100 kD，ECL发光液（美国Millipore公司）；外泌体提取试剂盒（美国Systembio公司）；DAPI溶液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 细胞培养

常氧培养：将人胰腺癌PaTu8988细胞株用含10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

低氧培养：将细胞置于密封的低氧培养盒中，向低氧培养盒里充入低氧混合气［（1% O2，5% CO2，94% N2），购自南大恒通气体厂］，持续充入10 min，然后将低氧培养盒转移到37℃培养箱中培养。

1.3 外泌体提取

取常氧和低氧培养后的细胞上清液于50 mL离心管，4℃行2 000×g离心20 min，去除细胞碎片；取上清液，于高速离心管中，10 000×g离心30 min；取上清液至Millipore超滤管中，1 000×g离心30 min；取上清液，0.22μm滤器过滤至15 mL离心管中；按照外泌体提取试剂盒1∶5比例加入到浓缩液中，4℃静置过夜；1 500×g离心30 min，弃上清液；1 500×g离心5 min；弃上清液后用100～500μL PBS重悬。

1.4 蛋白质印迹法检测细胞相关蛋白的表达

收集PaTu8988细胞和上清液，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，100℃煮沸5 min；12 000×g离心5 min，所得上清液即为蛋白样品。以每个泳道20μL蛋白样品上样，行10% SDS-PAGE；将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；加入一抗，4℃孵育过夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min；二抗37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；ECL发光试剂显影，在凝胶成像系统上拍照并分析。一抗分别为兔抗人单克隆抗体HIF-1α（1∶1 000），兔抗人多克隆抗体HMGB1（1∶1 000），兔抗人单克隆抗体HSP70（1∶1 000），鼠抗人单克隆抗体CD9（1∶200），鼠抗人单克隆抗体CD63（1∶200），鼠抗人单克隆抗体CD81（1∶200）；内参为兔抗人单克隆抗体β-微管蛋白；二抗分别为羊抗兔二抗（均1∶10 000），羊抗鼠二抗（1∶10 000）。

1.5 免疫荧光法检测PaTu8988细胞中HMGB1和CD63的表达

将盖玻片自75%乙醇中取出，轻轻放入24孔培养板；将经过计数的细胞悬浮液接种于培养板中，将盖玻片完全浸没，于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育过夜；设常氧组和低氧组，分别按照常氧和低氧处理；用PBS清洗细胞玻片1次；以4%低聚甲醛室温固定20 min；PBST浸洗玻片3次；滴加3%BSA血清，室温封闭30 min～1 h；弃封闭液，每张玻片滴加兔抗人多克隆抗体HMGB1（1∶1 000）和鼠抗人单克隆抗体CD63（1∶50）一抗混合液（1%BSA配制），放入湿盒，4℃孵育过夜；PBST浸洗3次，吸干多余液体；滴加Cy3标记山羊抗兔IgG和FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗混合液（均为1∶200），湿盒中20～37℃孵育1 h；PBST浸洗3次；滴加DAPI，避光孵育10～15 min；PBST洗4次；吸干多余液体，封片液封片，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察并采集图像。

1.6 生物信息学分析

下载美国癌症基因组图谱计划（The cancer genome atlas，TCGA）和高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）GSE16515中胰腺癌患者的临床相关数据，分析健康者和患者胰腺组织中HMGB1 mRNA表达水平。将患者按HMGB1 mRNA表达水平分组，低于均值为HMGB1低表达组，高于均值为HMGB1高表达组，分析并比较两组患者的生存期。

1.7 统计学分析

应用GraphPad Prism 6.0统计软件对数据进行分析。实验数据用均数±标准差（±s）表示，每组实验独立重复3次。两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，胰腺癌患者生存率分析采用Log-rank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGB1在胰腺癌标本中的表达

经分析，GSE16515数据库中共有52例样本，其中健康胰腺组织样本16例，胰腺癌组织样本36例。与健康组织相比，胰腺癌组织中HMGB1 mRNA呈高表达（t＝4.532，P＜0.01）。TCGA数据库分析结果显示，在胰腺癌患者中，HMGB1高表达者生存率明显低于HMGB1低表达者（n＝182，χ2＝5.493，P＜0.05）。见图1。

图1 GEO和TCGA数据库分析HMGB1的表达

2.2 低氧不同时间胰腺癌细胞培养上清液中HMGB1的含量

蛋白质免疫印迹结果表明，PaTu8988细胞在低氧培养6 h时，HIF-1α表达最高（P＜0.01）；在低氧培养48 h后，上清液中HMGB1的表达显著增多（P＜0.05），细胞内HMGB1表达量明显少于低氧培养6，12，24 h（P＜0.05），见图2。由此表明，低氧诱导下，胞内HMGB1释放到细胞外。

图2 蛋白免疫印迹法检测细胞及培养上清液中相关蛋白的表达

2.3 低氧促进胰腺癌细胞释放外泌体且外泌体中含有HMGB1

由图3可见，与常氧组比较，低氧组外泌体的相关标记蛋白如CD9，CD63，CD81，HSP70和HMGB1均显著高表达（t分别为6.752，9.528，7.421，11.07，7.538，P均＜0.01）。TEM透射电镜结果显示（图4），外泌体提取试剂盒所提取的微囊泡具有膜结构，且直径在100 nm左右。

2.4 低氧条件下HMGB1与外泌体共定位

免疫荧光结果表明，与常氧相比，低氧状态下HMGB1（红色荧光）与外泌体的标记物CD63（绿色荧光）的共定位增多。见图5。

3 讨论

肿瘤微环境与肿瘤的发生发展密切相关［6］。低氧是包括胰腺癌在内的多种实体肿瘤的共同特征。越来越多的研究表明，低氧及其诱导释放的各种炎症因子与肿瘤的治疗后复发、转移及肿瘤干细胞维持等密切相关［7-8］。HMGB1主要位于真核细胞胞核中，因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度快而得名［9］。HMGB1在肿瘤组织中表达上调，且与肿瘤组织的恶性程度相关［10］。本研究的数据库分析结果与上述报道结果一致，由此表明，HMGB1在肿瘤的发生发展中起重要作用。

图3 外泌体相关蛋白和HMGB1的蛋白质印迹检测结果

图4 常氧和低氧上清液中外泌体的形态结构（TEM，×46 000）

图5 常氧和低氧条件下HMGB1和外泌体的共定位

当细胞处于稳态时，HMGB1主要位于胞核内；当外界有适当的信号刺激细胞时，HMGB1的赖氨酸残基被乙酰化从而释放到胞外。目前HMGB1主要有两种释放方式，一种是主动释放，如免疫细胞主动释放HMGB1应对外源性微生物的入侵；另一种为被动释放，即当细胞发生死亡，如坏死、凋亡、自噬性细胞死亡等，或者在多种应激情况下，如化疗、放疗、低氧等，都可使得HMGB1被动释放至细胞外。本研究结果也证实低氧可促进HMGB1释放。目前已知参与HMGB1被动释放的通路有PARP1通路，RIP3通路，组织蛋白酶通路，抗氧化酶通路等。这些主动或被动释放到胞外的HMGB1参与细胞的多种过程，如促进细胞分化［11-13］、炎症反应、细胞迁移、组织再生［14］、血管生成［15-16］、细胞增殖［17］以及死亡［18］等。HMGB1在结肠癌、乳腺癌和肺癌等多种肿瘤的发生发展中起重要作用［19］，不但能增强肿瘤对治疗的敏感性，还可在某些抗肿瘤的治疗中致肿瘤产生抗性。

外泌体可由各种正常细胞分泌，如网织细胞、肥大细胞、树突状细胞等，也可由肿瘤细胞分泌。在某些应激条件下，外泌体释放增多，如缺氧、氧化应激、pH改变、放疗等［20］。研究表明，低氧能够促进乳腺癌细胞释放外泌体［21］。本研究结果表明，低氧能够促进胰腺癌细胞释放外泌体。外泌体的显著特征就是会携带大量的核酸和蛋白。本研究结果显示，低氧条件下人胰腺癌PaTu8988细胞释放的外泌体可以携带HMGB1。且有研究表明，在氧化应激条件下，羊膜上皮细胞来源的外泌体会释放HMGB1［22］。但HMGB1是如何转运入外泌体及其生物学功能目前还不清楚，有待后续进一步研究。

综上所述，低氧会促进人胰腺癌细胞释放HMGB1，且可以通过外泌体途径释放。