血栓调节蛋白在大鼠深静脉血栓模型中的表达及其意义

成曦，孙宝兰，苏张瑶，张玉泉

(1. 南通大学医学院，南通 226001； 2. 南通大学附属医院妇产科，南通 226001)

深静脉血栓(deep vein thrombosis，DVT)是一类严重危害人类健康的常见疾病，因其可引起致命性肺栓塞被临床医师广泛关注，科学合理的 DVT动物模型有助于研究深静脉血栓的作用机制、诊断及治疗[1-3]。深静脉血栓形成与内皮细胞损伤密切相关，内皮细胞具有分隔血小板和凝血因子与促凝的内皮下细胞外基质，并具有抗凝血酶和促进纤维蛋白溶解的作用[3-4]。血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)属于一种跨膜糖蛋白， 存在于所有血管内皮细胞表面，不仅是重要的抗凝辅助因子，也是血管内皮细胞受损的特异分子标志之一。TM分为膜型TM和可溶性TM(soluble thrombomodulin, sTM)两种存在形式，膜型TM存在于细胞表面，sTM 是膜型TM经蛋白酶裂解脱落形成的一种可溶形式[5]。在多种内皮细胞损伤性疾病中，可在血浆、尿液、关节滑液中检测到sTM升高，其表达水平与内皮细胞损伤程度、病变血管范围和病情轻重严重程度呈正相关[5-9]。虽然已有研究表明[10]，TM在肺栓塞中表达明显增加[10]，但它在DVT中的作用尚不清楚。因此，本研究拟在大鼠DVT模型的基础上观察血栓形成和消退过程中TM的表达，为临床DVT的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠10 ～ 12周龄66只，体重250 ～ 300 g，购于南通大学医学院实验动物中心【SCXK(苏)2014-0001】，饲养于南通大学实验动物中心屏障环境中【SYXK(苏)2017-0046】。饲养期间给予大鼠无菌饲料饮用水(均由南通大学医学院实验动物中心提供)。饲养环境：昼夜各12 h交替，湿度恒定，温度20 ～ 25℃。无菌手术在南通大学实验动物中心屏障动物实验设施完成【SYXK(苏)2017-0046】。本实验由南通大学实验动物伦理委员会审批通过(20170930-001)。

1.1.2 试剂与仪器

TM ELISA试剂盒购买自美国AMEKO公司，TRIzol试剂购买于美国 Invitroge公司，逆转录试剂盒均购买于日本TaKaRa公司。荧光定量PCR仪(StepOne)、冷冻离心机(Fresco 17)、普通PCR仪(2720)、超微量分光光度计(One Drop)。

1.2 方法

1.2.1 分组

将SD大鼠(66只)随机分成实验组(每个时间点6只，n=10×6只)和对照组(n=6只)。

1.2.2 模型建立

术前 12 h 禁食，不限饮水，称量大鼠体重，将0.3%的戊巴比妥钠按30 mg/kg经腹腔注射麻醉。固定好大鼠，进行腹部手术区备皮及消毒。在大鼠腹部正中做一2 cm切口，逐一打开皮肤层、筋膜层、肌肉层，显露和分离左肾静脉以下的下腔静脉分支至髂静脉水平。用 5-0 爱惜康缝线逐一结扎左肾静脉以下的下腔静脉分支至髂静脉水平。结扎下腔静脉分支后，在结扎点穿过 5-0 爱惜康缝线，另取 1 根 4-0 爱惜康缝线与下腔静脉主干并排， 5-0 缝线方结打结之后，谨慎抽出并排的 4-0 缝线，并开始计时。逐层关腹，消毒皮肤。术后1 h、4 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d后，继续上述麻醉、固定、消毒步骤，逐层开腹，使用负压管进行腹主动脉采血2 mL。将大鼠置于冰上，下腔静脉管壁较薄，透过管壁可见血栓呈暗红色，使用游标卡尺原位测定血栓长度(mm)。剪下左肾静脉以下的下腔静脉分支至髂静脉水平，剥离动脉及附属组织筋膜。肉眼观察下腔静脉内血栓形成情况，再经HE染色确定。将剩余静脉及血栓使用电子天平进行称重(g)，称重完成后将下腔静脉内皮与血栓分离。对照组大鼠采用上述方法开腹分离下腔静脉主干及分支后，仅穿过缝线，不结扎血管，其余处理过程相同。

1.2.3 ELISA检测血浆中TM表达

将负压管与含枸橼酸钠溶液的抗凝管相连，抽血完毕，将抗凝管上下颠倒混匀，以4000 r/min离心5 min，收集上清液，存入-80℃冰箱待测。采用ELISA测定血浆sTM值，严格按照大鼠TM的ELISA试剂盒要求操作。

1.2.4 实时荧光定量PCR反应

在大鼠的内皮和血栓样本中分别加入1 mL TRIzol匀浆，依次经氯仿、异丙醇等抽提法提取总RNA，采用分光光度计测定总RNA浓度及纯度。以Oligo(dT)15为引物进行逆转录，以β-actin作为内参照，PCR反应条件为:预变性95℃ 5 min；变性95℃ 15 s，退火60℃ 60 s，延伸95℃ 15 s，共45个循环；60～95℃每上升0.3℃收集荧光绘制熔解曲线。其中引物序列如下：TM上游 5′-GAT TTT CAG ACG CTG CCG ATA G-3′，下游5′-CAG AGT TCG TTG CAC AAT TGA G-3′；β-actin上游：5′-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA-3′；下游5′-GGG GTG T TG AAG GTC TCA AA-3′，2-ΔΔCt计算TM mRNA相对表达。实验重复检测3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 实验动物存活率和成栓率

实验过程中，模型组和对照组均无大鼠的意外死亡，模型组和对照组的大鼠存活率为100%。对照组无血栓形成，模型组造模后1 h成栓率为33.3%(2/6)，4 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d成栓率为100%(6/6)，21、28 d成栓率分别为66.7%(4/6)，50%(3/6)。大鼠下腔静脉产生的血栓头部为白色血栓，中间为混合血栓，尾部为红色血栓，见图1。

注：A.肉眼观下腔静脉血栓形态；B.下腔静脉内有血栓形成；C.下腔静脉内无血栓形成。图1 典型下腔静脉血栓形态及HE染色切片结果Note. A. Gross appearance of an inferior vena cava thrombus. B. A cross section of the inferior vena cava thrombosis. C. No thrombosis in the inferior vena cava.Figure 1 Typical gross appearance of a thrombus and microscopic image of the inferior vena cava thrombosis(HE staining)

2.2 血栓重量/长度比值变化

血栓重量/长度比值在造模后4 h最低[(28.65±1.01)g/mm]，造模后7 d达高峰[(60.78 ± 0.73)g/mm]。在造模后1、4、6、12 h血栓重量/长度比值较低，分别为[(29.15 ± 0.56)、(28.65 ± 1.01)、(29.01 ± 0.50)、(28.94 ± 0.89)g/mm]，四组间比较差异无显著性(P> 0.05)。在造模后24 h、3 d、7 d血栓重量/长度比值达到高峰，分别为[(59.66 ± 0.64)、(60.73 ± 0.49)、(60.78 ± 0.73)g/mm]，但又稳定在一定范围内，三组间比较差异无显著性(P> 0.05)。造模后14 d开始，血栓重量/长度比值开始下降，在21 d已出现部分大鼠下腔静脉血栓的完全消退，但14、21、28 d血栓重量/长度比值仍然稳定在一定范围内，分别为[(36.56 ± 0.62)、(35.84 ± 0.42)、(36.49 ± 0.46)g/mm]，三组间比较差异无显著性(P> 0.05)。见图2。

注：组间比较，#P > 0.05。图2 造模后不同时间点血栓重量/长度比值Note. Comparison between groups,#P> 0.05.Figure 2 Thrombus weight/length ratio at different time points after modeling

2.3 ELISA检测结果

血浆中sTM均较对照组高，差异有显著性(P< 0.01)。血浆中sTM在对照组中浓度最低[(16.26 ± 0.20)μg/L]，在造模后28 d达高峰[(24.07 ± 0.34)μg/L]。造模后1、4、6、12 h内血浆中sTM浓度逐渐增加，分别为[(18.70 ± 0.19)、(18.94 ± 0.37)、(19.00 ± 0.23)、(19.03 ± 0.31)μg/L]，组间比较差异无显著性(P> 0.05)；虽然sTM值在24 h、3 d、7 d后仍然有所升高并在小范围波动[(21.88 ± 0.14)、(22.26 ± 0.23)、(21.75 ± 0.14)μg/L]，但三组间比较差异无显著性(P> 0.05)；sTM在14、21、28 d稳定在最高水平[(24.04 ± 0.21)、(23.97 ± 0.33)、(24.07 ± 0.34)μg/L]，三组间比较差异无显著性(P> 0.05)。见图3。

注：与对照组相比，**P< 0.01；组间比较，#P> 0.05。图3 造模后不同时间点血浆sTM 浓度Note. Compared with the control group,** P < 0.01. Comparison between groups,#P > 0.05.Figure 3 Plasma sTM concentration at different time points after modeling

2.4 实时荧光定量PCR检测结果

2.4.1 血栓TM mRNA表达

血栓TM mRNA随时间推移总体呈逐渐升高的趋势，造模后1 h表达量最低(1.02 ± 0.17)，造模后14 d表达量最高(3.87 ± 0.47)。造模后1、4、6、12 h血栓TM mRNA表达量稳定在一较低水平，分别为(1.02 ± 0.17)、(1.18 ± 0.17)、(1.15 ± 0.14)、(1.20 ± 0.11)，四组间比较差异无显著性(P> 0.05)；血栓TM mRNA表达在24 h快速升高，但其与3、7 d 的TM mRNA表达无显著性差异[(2.44 ± 0.16)、(2.73 ± 0.39)、(2.70 ± 0.26)，P> 0.05]；14、21、28 d内皮TM mRNA表达进一步升高，分别为(3.87 ± 0.47)、(3.80 ± 0.49)、(3.70 ± 0.21)，三组间比较差异无统计学意义(P> 0.05)。见图4。

注：组间比较，#P > 0.05。图4 造模后不同时间点血栓TM mRNA表达Note. Comparison between groups,#P > 0.05.Figure 4 Thrombus TM mRNA expression at different time points after modeling

2.4.2 内皮TM mRNA表达

对照组内皮TM mRNA也有一定的表达(1.02 ± 0.15)，在造模后12 h达到最高峰(2.43 ± 0.40)，TM mRNA表达在造模后3 d到达最低水平(0.12 ± 0.02)。造模后1、4、6、12 h内皮TM mRNA表达较对照组高，分别为(2.29 ± 0.21)、(2.33 ± 0.22)、(2.33 ± 0.30)、(2.43 ± 0.40)，与对照组相比，差异有显著性(P< 0.01)，但四组间比较差异无显著性(P> 0.05)；内皮TM mRNA表达在24 h、3 d、7 d较对照组低(0.13 ± 0.02)、(0.12 ± 0.02)、(0.13 ± 0.01)，与对照组相比，差异有显著性(P< 0.01)，但三组间比较差异无显著性(P> 0.05)；14、21、28 d内皮TM mRNA值较为稳定，分别为(1.10 ± 0.07)、(1.0 ± 0.10)、(0.89 ± 0.17)，与对照组相比差异无显著性(P> 0.05)。见图5。

注：与对照组相比，**P< 0.01；组间比较，#P> 0.05。图5 造模后不同时间点内皮TM mRNA表达Note. Compared with the control group,** P < 0.01. Comparison between groups,#P > 0.05.Figure 5 Endothelial TM mRNA expression at different time points after modeling

2.5 相关性分析

由以上结果可见，血栓重量/长度比值、血浆sTM、血栓TM mRNA和内皮TM mRNA呈现出相同的三个时间分期(1 ～ 12 h、24 h ～ 7 d、14 ～ 28 d)。其中，血栓重量/长度比值和内皮TM mRNA变化趋势相反，相关性分析结果显示，血栓重量/长度比值和内皮TM mRNA呈显著负相关(r=-0.92，P< 0.01)；血浆sTM和血栓TM mRNA总体均呈逐渐升高趋势，相关性分析结果显示，血栓TM mRNA和血浆sTM呈正相关(r=0.96，P< 0.01)。

3 讨论

本研究采用“狭窄法”建立大鼠深静脉血栓模型，选取建模后10个时间点模拟血栓形成及稳定的整个过程。以血栓重量/长度比值衡量血栓演变过程，探讨DVT自然演变过程中TM的表达及意义。

3.1 大鼠DVT模型研究现状

大鼠血栓模型较多，包括肠系膜上静脉，下腔静脉，股总静脉等[11]。大鼠下腔静脉属于大静脉，便于观察，且既往研究发现大鼠下腔静脉模型成栓率较高，最高可达100%[12-13]。下腔静脉血栓的造模方法主要包括“完全结扎法”、“狭窄法”、“FeCl3注射法”和“电刺激法”[14-15]。由于“狭窄法”操作简单且贴近人体自然血栓形成，不影响大鼠存活，故本研究最终选择采用大鼠下腔静脉“狭窄法”造模，时间点的选择参考白云城[12]、付健等[13]研究。本实验结果说明使用“狭窄法”造模，大鼠血栓形成和消退时间早晚不一；血栓最早在1 h形成，最晚在2 h开始形成；血栓最早在造模后21 d消退，造模后28 d仍有大鼠的血栓未完全消退，最晚消退时间我们将在后期进一步研究。建模后大鼠DVT最快在1 h形成，此结论与Aghouria等[16]研究结论相符。大鼠DVT开始形成与完全消退时间早晚不一与大鼠个体差异及对血栓性疾病遗传易感性不一相关。

如果将血栓看成柱体，血栓重量/长度比值代表血栓密度和横截面积的乘积，血栓横截面积与血栓患者病情严重情况密切相关，而密度与血栓演变过程中机化、再通等有关，血栓重量/长度比值能更客观全面衡量血栓病理变化。本研究中使用栓子重量/长度比值衡量血栓演变过程，与刘海平等[17]、Sun等[18]衡量血栓形成和消退方法一致。本研究结果显示，模型组大鼠造模后血栓重量/长度比值在造模早期(1、4、6、12 h)较低，差异无统计学意义，为血栓形成期。在造模后24 h、3 d、7 d血栓重量/长度比值有了较大提高，但又稳定在一定范围内，为血栓稳定期。造模后14 d开始，血栓重量/长度比值开始下降，在21 d已出现部分大鼠下腔静脉血栓的完全消退，但14、21、28 d血栓重量/长度比值差异无显著性，为血栓消退期。

3.2 TM与DVT疾病关系的探讨

ELISA结果显示，血栓自然演变过程中，各时间点的血浆中sTM浓度与对照组相比均有统计学差异，此结果说明TM作为一种重要的抗凝及抗纤维沉积的因子，在血栓自然演变的整个过程中均起着重要作用。深静脉血栓疾病本身就是一个动态变化的过程，血栓形成、稳定和消退是一个炎症与免疫反应共同参与的过程，在此过程中有多种细胞因子如：TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等的参与，sTM与这些因子共同作用，影响血栓形成和消退[4,17-18]。

PCR结果显示，血栓自然演变过程中血栓TM mRNA表达总体呈逐渐升高的趋势，与血浆sTM浓度呈正比。TM主要由血管内皮细胞产生，约99%以上的血管内皮细胞表达TM，此外，胎盘滋养层细胞、血小板、巨核细胞、单核细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等表面也可以表达TM。大鼠DVT模型中的下腔静脉血栓属于混合血栓，包含血小板、红细胞、成纤维细胞等多种成分[4]。膜型TM可以在血小板、中性粒细胞等多种细胞表面表达[5]，sTM 是膜型TM经蛋白酶裂解脱落形成的一种可溶形式[8]，血栓TM mRNA表达和血浆中sTM总体均呈升高趋势，血栓当中的膜型TM越多，脱落到血浆中的sTM也越多。此外，随着血栓内新生血管增加，内皮细胞上表达的膜型TM也逐渐增加。

内皮TM mRNA在血栓演变过程中呈现出与血栓重量/长度比值相反的变化趋势，两者呈显著负相关。血栓形成期(造模后1～12 h)血管壁周围少量炎症因子刺激血管内皮，导致内皮损伤，内皮上膜型TM大量生成，内皮TM mRNA表达明显增加。血栓稳定期(造模后24 h～3 d)肿瘤坏死因子α等多种炎症因子可以下调TM mRNA的表达[19-20]，故内皮TM mRNA表达显著降低，且肺动脉高压大鼠模型中也观察到类似的TM mRNA降低现象。血栓消退期(造模后14～28 d)内皮TM mRNA表达水平较低，与对照组相比无统计学差异，提示内皮TM具有良好的预后作用。

分析以上结果，我们推测：TM作为内皮损伤标记物，血栓形成期，血管内皮损伤，内皮细胞开始合成并释放TM；血栓稳定期，内皮TM合成受阻，血栓中大量膜型TM脱落至血浆；血栓消退期，内皮细胞损伤基本恢复，内皮细胞已不产生或仅产生少量TM，血栓中产生TM较多。

本研究通过建立大鼠下腔静脉血栓模型观察DVT自然演变过程中TM的表达及意义，采用血栓重量/长度比值衡量血栓演变，发现内皮TM mRNA表达与血栓重量/长度比值成反比，其含量随着血栓的病理进展而改变，在形成期较高，稳定器达低峰，消退期稳定，说明内皮TM mRNA的表达变化可以反映DVT的病情进展，具有良好的预后作用。在后期的研究中，我们将对TM在DVT演变过程中的功能作用及其分子机制做深入探讨。