合子基因mcm3在斑马鱼肝早期发育中的作用

刘敏，何兴，蒲晓华，张雨，陈炳宇，黄四洲

(1. 成都医学院基础医学院，成都 610500； 2. 成都医学院生物医学系，成都 610500； 3. 成都医学院基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室；发育与再生四川省重点实验室，成都 610500)

在胚胎发育过程中细胞同时进行细胞增殖和细胞分化两个重要过程[1]。在细胞周期过程中，小染色质复合体(MCM2-MCM7)在DNA复制起始中起着重要的作用[2]。在细胞周期M期到G1期的转换期，通过ORC、CDC6和 CDT1等的介导作用，MCM复合体首先结合于DNA复制原点处。然后在G1和S期转换期形成前复制复合体(pre-RC)以启始DNA的复制。在MCMs复合体形成初始阶段，MCM2-7以一种非活性的六聚体形式环抱双联DNA(dsDNA)[3-4]。到G1与S期转换时，在DKK调控下Cdc45和GINS与MCM复合体发生结合以形成2CMG(Cdc45-MCM-GINS)复合体，从而使得MCM复合体的解旋酶活性得以激活[5]，起始DNA复制。MCM3是MCM家族的重要成员之一,最近直接被证实对于ORC/CDC6/CDT1/MCM2-7复合体的形成起着至关重要的作用[6]。同时发现MCM3磷酸化使得细胞周期不能通过细胞周期鉴定点[7]，从而导致细胞周期不能正常进行。另一方面作为MCM家族成员之一的MCM3， 在胚胎发育早期被认作是增殖细胞的重要标记基因， 当细胞周期减慢时，其表达降低，而在终末分化细胞中，MCM3不容易被检测到[8]。相应的在肝癌、宫颈癌等众多快速增殖的癌症细胞中，MCM3、Ki67及PCNI等增殖标记基因均呈高表达[9-12]。因此MCM3也被用作在胚胎发育及疾病发生中细胞增殖的重要标记基因。

MCM家族作为细胞周期DNA复制起始的调控因子及增殖细胞的标记基因已被广泛研究。但在增殖细胞中MCM家族的表达量远大于DNA复制所必须，暗示该家族成员在胚胎发育过程中可能参与了DNA复制以外的其他生物学功能[13-14]。最近研究发现，在斑马鱼中家族成员之一mcm2作为foxn1的下游基因调控了胸腺T细胞的增殖[15]；mcm5也可能通过非细胞周期依赖性方式调控了体节极性的决定[16]；在小鼠中过量表达的MCM3也被证实在发育环境压力下保证了红细胞的成熟[17]。这些研究均表明MCM家族成员在胚胎发育过程中确实起着重要的作用。最近研究发现mcm3在斑马鱼中存在母源性mcm3及合子基因mcm3。斑马鱼胚胎过表达母源性基因mcm3导致细胞增殖受阻，尾部发育缺失[18]，但是合子基因mcm3在发育中作用仍不清楚。

斑马鱼有体外受精、遗传操作简单、早期胚胎透明、发育迅速的优点，已经被广泛运用到器官发育的研究中[19-20]。本研究首先研究斑马鱼合子基因mcm3在胚胎早期发育中的表达模式，发现mcm3在肝等内胚层器官前体细胞中大量表达，暗示其可能参与了肝发育。进一步运用MO注射敲降及mRNA回救的方法研究发现，合子基因mcm3功能敲降使得肝变小，并且这种表型可以较好的被mcm3 mRNA回救。同时我们发现mcm3功能敲降并不影响心脏和血管的发育，暗示mcm3特异的参与了肝发育的早期调控。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本文所用斑马鱼品系包括野生型(AB品系)和Tg(Ifabp10:GFP)，Tg(flk1:GFP)，Tg(cmlc2:GFP)三种转基因品系。三种转基因品系由黄红辉教授和孙华钦老师赠送。斑马鱼严格按照标准饲养条件喂养[21]，实验胚胎在28.5℃孵育箱中孵育至实验所需日期。

1.1.2 试剂与仪器

探针合成试剂盒为DIG RNA Labeling kit(Roche)；Mopholino购自GeneTools公司(mcm3MO：5-AAAAGTTCAGTGCAGAACACCTCGT-3；ContMO：5-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3)；mRNA合成试剂盒为mMessage mMachine SP6 (Ambion-Thermo Fisher)；cDNA反转录试剂盒为Reverse Transcription (#K1622,Thermo)；原位杂交试剂盒(Roche)；限制性内切酶及Q5高保真酶(NEB)；PCR purification kit (D6492-01,Qiagen)；拍照所用显微镜主要为Olympus SZX2-ILLT和Olympus U-HGLGPS荧光显微镜。

1.2 方法

1.2.1 MO和mRNA注射

利用mMessage mMachine SP6转录试剂盒(Ambion-Thermo Fisher, UK)体外合成了注射用斑马鱼的全长mcm3 mRNA。将mcm3 MO(300 μmol/L)和mRNA (100 ng/μL)分别或共注射于1～4细胞期的斑马鱼胚胎中。

1.2.2 探针制备与原位杂交

用线性化载体或PCR产物为模板，使用sp6或T7转录酶合成地高辛标记的RNA反义探针(DIG RNA Labeling kit试剂盒)。纯化及电泳鉴定正确后，于-20℃保存备用。目的胚胎收集并用4%PFA固定过夜，第2天用PBST洗3次(每5 min 1次)，无水甲醇脱水3次(每次15 min)，最后放入-20℃备用。原位杂交流程按之前的报道方法进行[16]。

1.2.3mCherrymRNA和mcm5 mRNA的合成

用限制性内切酶将构建好的质粒酶切线性化，使用DNA纯化试剂盒回收线性化的DNA模板。后用mMessage mMachine SP6转录试剂盒体外转录合成mRNA, 再使用酚氯仿抽提mRNA，异丙醇沉淀。测浓度后跑胶检测并分装放于-80℃冰箱保存待用。

1.2.4 荧光体视显微镜拍照

活体胚胎用麻醉剂trican麻醉后拍照，原位杂交及其他需要定位的胚胎将胚胎放于100%甘油或1%低熔点琼脂凝胶中固定，后使用Olympus SZX2-ILLT或Olympus U-HGLGPS荧光显微镜观察及拍照。

2 结果

2.1 斑马鱼合子基因mcm3在胚胎早期发育中的表达模式

为研究合子基因mcm3在斑马鱼发育早期中的作用及功能，我们运用整胚原位杂交检测mcm3基因在斑马鱼中的时空表达模式。研究表明，mcm3在胚胎中囊胚转换前未见表达(图1D)，在bud时期及以前mcm3广泛表达(图1A)。在体节发生期到24 hpf，mcm3基因广泛表达于头部，眼睛，体节以及内胚层区域(图1B)。受精后48 h～4 d(图1C，E-G)，mcm3基因在头部，鱼腮及胸腺等区域高表达，且在肝等内胚层组织器官有较强的表达(箭头所指)。以上数据表明，合子基因mcm3在胚胎早期发育过程中可能参与了肝内胚器官发育的调控。

注：A-G. mcm3在胚胎各个时期的表达模式。mcm3在4细胞期不表达(D)，在bud时期呈广泛表达(A)。在24 hpf mcm3主要表达在头部、眼睛及内胚层区域(B，箭头所示)；在48 hpf 主要在眼睛、中后脑边缘、腮及内胚层表达(C); 在72 hpf之后主要在腮、中后脑边缘及部分内胚层组织表达(E-G)。图1 mcm3在斑马鱼发育早期的表达模式Note. A-G. The expression pattern of mcm3. mcm3 was not expressed in the 4-cell stage (D), it was expressed ubiquitously in the bud stage (A), while the expression was restricted in the head, eye and endoderm related tissues at 24 hpf. At 48 hpf, it was dominantly expressed in the eye, the boundary of mid-hindbrain, gill and endoderm tissues (C). After 72 hpf, mcm3 was only expressed in the boundary of mid-hindbrain, gill and partial part endoderm tissues (E-G).Figure 1 Expression pattern of mcm3 in early development of zebrafish

注：A. 标记mcm3 MO所对应的基因位点；B. mCherry mRNA的设计策略；C. 单独注射mCherry mRNA及共注射mCherry mRNA和mcm3 MO后胚胎荧光表达图。图2 mcm3 MO设计及功能验证Note. A. Gene locus of mcm3 MO. B. Design strategy of mCherry mRNA. C. Fluorescence image of embryos after injection of mCherry mRNA alone and co-injection of mCherry mRNA and mcm3 MO.Figure 2 mcm3 MO designing and functional verification

2.2 合子基因 mcm3 MO的设计及功能验证

为研究mcm3敲降后是否影响胚胎早期内胚层肝的发育，我们合成了mcm3 MO以阻断胚胎内源性mcm3 mRNA的翻译(图2A)。与此同时，构建了体外转录的mCherry mRNA的载体以验证mcm3 MO是否工作。在该载体中于mCherry编码区的上游添加了一段完全与mcm3 MO相匹配的DNA序列，体外转录后获得mCherrymRNA可与mcm3 MO相结合(图2B)。如果合成的mcm3 MO能很好地抑制内源性mcm3 mRNA的翻译， 理论上mCherrymRNA的翻译也将受到mcm3 MO的抑制而表达减弱。结果显示，单独注射了mCherrymRNA的野生型胚胎，在Shield到70%外卵黄外包时期有较强的红色荧光。而共注射了mcm3 MO以及mCherrymRNA的胚胎中，红色荧光明显减弱(图2C)。以上结果间接表明，体外合成的mcm3 MO能很好的抑制胚胎内源性mcm3 mRNA翻译。

2.3 合子基因mcm3在肝发育中的作用

肝是内胚层来源的重要器官，为验证是否mcm3参与了肝的发育调控，我们在Tg(fapb10：GFP)转基因中注射mcm3 MO以阻断mcm3翻译来分析肝发育是否受到影响。结果表明，在mcm3功能敲降后胚胎发育早期没有任何缺陷(数据未提供)。待胚胎发育到第3天与对照组相比，眼睛稍微变小(图3 A，箭头)，但无明显的其他外观发育缺陷(图3A)。仔细分析进一步发现, 当mcm3功能敲降时3.5 d胚胎肝明显变小，只有正常胚胎肝的1/10左右(图3B)。为证实mcm3在肝发育中的特异性作用，我们在Tg(flk1:GFP)及Tg(cmlc2:GFP)转基因胚胎中注射mcm3 MO以敲降mcm3以分析血管和心脏的发育是否受到影响，但并未发现血管和心脏发育的明显异常(图3C-D)。以上结果表明，mcm3对胚胎早期肝的发育具有特异的正调控作用。

2.4 合子基因mcm3 mRNA对肝表型的回救

为验证mcm3在肝发育中的特异性作用，我们分析mcm3 mRNA是否能回救mcm3 MO注射导致的肝变小的表型。结果显示，与单独注射mcm3 MO的胚胎相比，共注射mcm3 MO及mRNA的Tg(lfabp10:GFP)胚胎在3.5 d时肝明显变大，表型得到回救(图4A，a1-a4，白色箭头)，这表明mcm3特异的参与了肝早期发育的调控。由于转基因背景的胚胎可能导致部分非特异性表型，为了进一步证实mcm3在肝早期发育中的作用，我们在野生型胚胎中检测肝发育早期的另一内源性标记基因cp。结果表明，在mcm3功能敲降时肝标记基因cp表达面积明显减小(图4B，b1-b2)，并且mcm3 RNA注射较好的回救了mcm3MO注射所导致的肝发育缺陷(图4C，c1-c3)。

注：A. 在胚胎发育第3天时注射mcm3 MO的胚胎眼睛稍微变小，但无其他任何畸形；B.与对照组比较mcm3功能敲降后肝明显变小(白色箭头标注)；C,D. mcm3功能敲降后血管(C)和心脏(D)发育正常。标尺：100 μm。图3 mcm3敲降后肝变小Note. A. On the third day of embryonic development, the embryo injected with mcm3 MO had a smaller eye but no other abnormalities. B. Compared with the control group, the liver was smaller after mcm3 knockdown (white arrow). C, D. After mcm3 knockdown, blood vessels (C) and heart (D) were developed normally. Bar=100 μm.Figure 3 Liver is smaller after mcm3 knockdown

注：A. 在单独注射control MO(a1)、mcm3 MO(a2)、mcm3 mRNA(a3)、共注射mcm3 MO和mcm3 mRNA(a4)的Tg(fabp10：GFP)转基因胚胎中肝的比较；B. 在野生型胚胎中，注射mcm3 MO导致胚胎肝变小；C. 在野生型胚胎中mcm3 mRNA注射回救了注射mcm3 MO胚胎中的肝发育缺陷。标尺：100 μm。图4 mcm3 mRNA注射回救了mcm3 MO注射后的肝发育缺陷Note. A. Comparison of liver in the Tg (fabp10:GFP) transgenic embryos with control MO (a1), mcm3 MO (a2), mcm3 mRNA (a3), co-injection of mcm3 MO and mcm3 mRNA (a4). The liver in Tg(fabp10：GFP)embryos injected with control MO (a1), mcm3 MO (a2), mcm3 mRNA (a3), respectively, as well as embryos co-injected with mcm3 MO and mcm3 mRNA (a4). B. In the wild-type embryos, injection of mcm3 MO resulted in a smaller liver than the control embryos. C. In wild-type embryos, mcm3 mRNA was injected to rescue the liver development defects caused by injection of mcm3 MO. (arrow). Bar=100 μm.Figure 4 mcm3 mRNA rescued the liver development defects caused by mcm3 MO injection

3 讨论

虽然MCM家族在细胞周期中调控DNA复制的功能已经很清楚，但是其在胚胎发育中的功能报道较少。在小鼠中MCM3功能敲除使得红细胞不能正常成熟，血液干细胞功能缺陷[17]，但其在其他增殖细胞中的功能未见报道。我们课题组运用斑马鱼模式动物研究的优势，对合子基因mcm3在胚胎发育早期的表达模式以及其在肝发育中的功能进行了研究。表达模式表明合子mcm3全长基因表达模式与我们已经报道的mcm5的表达有许多相似的地方[16]：在体节期前广泛表达，而后在体节、肌肉、神经、内胚层细胞处高表达。但以mcm3编码区的 5’端500 bp片段为探针进行原位杂交检测，发现mcm3在体节发生晚期及24 hpf只在体节大量表达，而在头部等区域表达很弱(数据未提供)，暗示合子mcm3可能存在另一个或多个不同的同源基因或者不同的剪切方式。最近有研究报道斑马鱼mcm3存在着母源性和合子转录两种类型[21]。 研究发现母源性mcm3基因过表达直接导致细胞增殖受阻，并且胚胎发育到24 h时尾部出现不同程度的变短或缺失，而过表达合子基因mcm3后的胚胎发育缺陷未见报道[21]。这些研究暗示在胚胎发育过程中， 在斑马鱼中可能mcm3较其他mcm家族因子其调控发育的具体过程及分子机制有一定不同之处，这为我们研究MCM家族细胞周期因子在发育中的功能开辟了一条新的道路。

在这里我们的研究表明mcm3调控了肝发育，但在调控肝发育过程中mcm3是通过细胞周期依赖还是非依赖的形式进行还不得而知；mcm3是否也调控了其他内胚层及外胚层组织的发育调控也有待我们后续的工作进一步阐明。