一种皮肤型狼疮小鼠模型的鉴定

钟荣玉，段新旺*，牛海涛

(1. 南昌大学第二附属医院 风湿免疫科，南昌 330006； 2. 国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,中国医学科学院医学实验动物研究所，国家中医药管理局，北京 100021)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE，以下简称狼疮)是一种累及全身多脏器的自身免疫性结缔组织病，发病机制尚不明确，环境因素的暴露[1]、激素水平紊乱[2]和感染等都是潜在的致病因素。狼疮患者常出现抗核抗体水平的升高，抗核抗体包括抗sm抗体、抗SS-A抗体和抗Scl-70抗体等，各抗体在不同自身免疫系统疾病中发挥着不同的作用[3]。而抗dsDNA抗体是狼疮疾病活动性的指标[4]，与狼疮肾炎有着密切关系，是临床诊断及治疗效果观察的一项重要指标。

皮肤病变在狼疮患者中，是继肾受累外，较为多见的病变部位[5]。年轻女性狼疮患者常见皮肤症状，表现为特异性皮损如蝶形红斑[6]、盘状红斑，非特异皮损光敏感、口腔溃疡、脱发、皮肤血管炎等。关于狼疮皮肤病变的原因，有研究认为可能和紫外线暴露[7]、淋巴细胞、炎症因子、免疫复合物等因素有关[8]，但具体机制未清，其主要原因在于目前尚未有很好的皮肤型狼疮动物模型加以研究。

TC小鼠是由C57BL/6 小鼠与狼疮NZM2410 小鼠多代杂交后建立的、同时携带三种狼疮易感基因簇(Sle1/Sle2/Sle3) 的纯合遗传性自发狼疮小鼠，即B6.NZMSle1/2/3小鼠(简称TC小鼠)，是一种以C57BL/6为背景的遗传性狼疮小鼠。该小鼠能够充分模拟人类系统性红斑狼疮的疾病表征，表现出升高的抗dsDNA抗体、抗ANA抗体和狼疮肾炎等典型狼疮症状[9]。本研究通过长期观察，发现该小鼠从40周龄开始出现皮肤病变，血清抗体检测及皮肤组化结果显示，该小鼠可作为研究慢性皮肤型狼疮发病机理的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

TC小鼠为美国佛罗里达大学Morel Laurence教授所赠送。C57BL/6 小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司【SCXK(京)2014-0004】，饲养在中国医学科学院医学实验动物研究所SPF动物房，所有实验操作在中国医学科学院医学实验动物研究所完成【SYXK(京)2015-0035】，实验经中国医学科学院医学实验动物研究所伦理委员会审批(NHT17002)。

1.1.2 试剂和材料

小鼠抗ANA抗体ELISA检测试剂盒购自ADI公司；标记抗体Goat Anti-Mouse IgG购自Southern Biotech公司；酶底物显色剂phosphatase substrate、包被抗原dsDNA及O.C.T冰冻组织包埋胶购自Sigma公司；17β雌二醇缓释片(1.5 mg/60 d)购自美国IRA公司；苏木素、伊红染色液购自北京盈利精细化工有限公司；乙醇、二甲苯溶液购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 观察和对比小鼠皮肤病变情况

观察老龄TC小鼠皮肤受损状况。将17β雌二醇缓释片植入8周的雌性TC小鼠皮下，观察记录出现皮肤症状的时间。将有皮肤症状的小鼠进行固定，分别暴露颈部、背部、耳廓部位皮肤，用软尺测量并计算皮损部位面积，用相机拍照。

1.2.2 血清抗ANA抗体及抗dsDNA抗体检测

采用脸颊采血法，收集40周龄以上雌性TC鼠与同龄C57BL/6小鼠的血液50 μL，室温静置1 h，9000 r/min 离心10 min，取上清。ELISA法检测血清相应抗体。

1.2.3 皮肤HE染色

取老龄TC小鼠病变部位皮肤，用O.C.T胶进行包埋，放置于-20℃冰箱保存。取6 μm冰冻切片进行HE染色，具体步骤：无水乙醇固定后苏木精液染色 2 min，流水洗净，盐酸乙醇(100 mL 70%乙醇 + 0.5 mL浓盐酸)脱去多余染色剂，再进行伊红染色，并经过80%乙醇、95%乙醇和100%无水乙醇脱水，二甲苯透明化切片，最后中性树胶封片。

1.3 数据分析及统计方法

2 结果

2.1 TC小鼠出现皮肤病变症状

经过对比发现，TC小鼠皮肤受累症状表现为被覆毛发脱失，主要见于背部(图1A)；颈部皮肤溃疡(图1B)；耳廓部皮肤溃烂(图1C)。而同龄C57BL/6小鼠则无皮肤病变表现(图1D)。经统计结果发现，66.6%的老龄TC小鼠会出现不同程度的皮肤受累症状,而同龄的C57BL/6小鼠则无皮肤病变(图1E)。TC小鼠出现典型的皮肤受损症状，与部分狼疮患者出现皮肤受累症状相符合。(如图1)

注：A.TC小鼠背部脱毛；B.TC小鼠颈部；C.TC小鼠耳廓部；D.同龄C57BL/6小鼠皮肤；E TC小鼠和C57BL/6小鼠数量及出现皮肤病变小鼠所占比例，阴影部位表示皮肤病变TC小鼠数目(n=30)。图1 同龄 TC和C57BL/6小鼠皮肤病变症状及出现皮肤受累的小鼠所占比例Note．A. TC mouse back hair loss. B. TC mouse neck. C. TC mouse auricle. D. Skin of the same age C57BL/6 mice. E. Number of TC mice and C57BL/6 mice and the percentage of mice with skin lesions. (n=30)Figure 1 Proportion of skin lesions and skin involvement in the same age TC and C57BL/6 mice

2.2 年龄在TC小鼠皮肤病变中发挥重要作用

TC小鼠的皮肤病变症状随着周龄的增大而逐渐加重。在38周前未发现皮肤受损情况，40周开始出现被覆毛发脱失，并且随着周龄增大，更多小鼠出现皮肤受累症状，已出现皮肤受损的小鼠则症状逐渐加重，表现为弥漫性脱毛，甚至发展为溃烂，白色粘液样物质渗出，症状严重者可累及眼球。随时间变化TC小鼠皮肤受累症状如图所示(图2)。结果显示，随着年龄的增长，皮肤受累的TC小鼠数量逐渐增加，皮损面积逐渐增大，症状逐渐加重，表明大部分TC小鼠在老龄出现皮肤症状，而同龄C57BL/6小鼠则无皮肤症状。

2.3 皮肤病变的老龄TC小鼠均表现为血清抗ANA抗体及抗dsDNA抗体阳性

两组小鼠血清抗dsDNA抗体检测结果如图3所示：TC小鼠血清抗dsDNA抗体OD值明显升高，C57BL/6小鼠抗dsDNA抗体(anti-double-stranded (ds) DNA antibodies)则全部为阴性(图3 A)。老龄TC小鼠血清抗ANA抗体(anti-nuclear antibodies)明显升高于同龄C57BL/6小鼠(图3B)，差异具有统计学意义(图3)。TC小鼠的血清抗dsDNA和抗ANA抗体较C57BL/6小鼠明显升高且具有显著差异，说明TC小鼠是典型的狼疮疾病小鼠。

2.4 TC小鼠的皮肤病变部位有大量淋巴细胞浸润

小鼠皮炎部位皮肤冰冻切片HE染色结果显示：TC鼠皮肤角质层缺失，上皮层连续性中断(图4 A)，真皮层大量淋巴细胞浸润，毛囊减少乃至消失(图4B)。而C57BL/6小鼠角质层及上皮层细胞完整(图4C)。为了探究老龄TC小鼠的皮肤症状属于急性还是慢病变，我们用17β雌二醇缓释片处理8周的雌性TC小鼠，4周后即可出现皮肤症状，其皮肤染色结果显示上皮层完全缺失，但未见明显淋巴细胞浸润(图4D)。老龄TC小鼠皮肤真皮层有大量淋巴细胞浸润，而17β雌二醇处理的TC小鼠皮肤真皮层淋巴细胞明显减少，两种皮肤病变呈现明显差异，且都与同龄C57BL/6小鼠有明显不同(如图4)，表明老龄TC小鼠的皮肤病变较符合慢性皮肤病变。老龄TC小鼠血清自身抗体水平升高，皮肤大量淋巴细胞浸润，说明皮肤病变和自身免疫存在紧密联系。

注：A.皮肤病变的TC小鼠数目随着周龄增加而增多(n=20)；B. TC小鼠皮肤受损面积随着周龄增加而增大(n=20)。图2 皮肤病变的TC小鼠数目增多及皮肤损伤面积逐渐增大Note. A. Number of the TC mice with skin lesions was increased with increasing age (n=20). B. Area of skin lesions in the TC mice was increased with increasing age (n=20).Figure 2 Increased number of TC mice with skin lesions and increased skin lesion area

注：a.C57BL/6小鼠与TC 小鼠的抗dsDNA OD值对比 (n=20)，***P < 0.05。b. C57BL/6小鼠与TC小鼠的抗ANA OD值对比(n=20)，*P < 0.05。图3 TC小鼠与C57BL/6小鼠抗dsDNA 与抗ANA 抗体浓度Note. A. Comparison of the OD values of anti-ANA antibodies between C57BL/6 and TC mice (n=20).***P< 0.05. B. Comparison of the OD values of anti-dsDNA antibodies between C57BL/6 and TC mice (n=20).*P< 0.05.Figure 3 Concentrations of Anti-dsDNA and anti-ANA antibodies of the C57BL/6 and TC mice

注：A. TC小鼠上皮层中断；B. TC小鼠真皮层大量淋巴细胞浸润，毛囊减少乃至消失；C. C57BL/6小鼠皮肤；D. 17β雌二醇处理的年轻雌性TC小鼠皮肤上皮层缺失。图4 TC小鼠与C57BL/6小鼠皮肤的病理改变Note. A. Disruption of the epithelium in a TC mouse. B. Extensive lymphocyte infiltration in the dermis of a TC mouse. C. The skin tissue of a C57BL/6 mouse. D. Loss of skin epithelial layer in a 17β-estradiol-treated TC mouse.Figure 4 Pathological changes of the skin in TC and C57BL/6 mice

3 讨论

3.1 TC小鼠是一种典型的用于研究狼疮发病机制的小鼠模型

系统性红斑狼疮是一种免疫紊乱的疾病，主要特点是自身抗体水平的升高。其常见的抗体为抗核抗体[10]，同时抗dsDNA抗体是狼疮的特异性和疾病严重程度标志[11]，在狼疮的诊断和治疗中发挥重要作用。在TC小鼠的研究报道中指出，在树突状细胞作用下[12]，B细胞介导的炎症因子IL-6 和 IFN-γ表达升高，影响了B细胞活化，过度活化的B细胞和树突状细胞相互作用，分化为浆细胞并分泌自身抗体继而引起各系统和脏器的损伤[13]。所以，TC小鼠作为一种遗传狼疮动物模型，能较好的模拟狼疮的发病症状并用作皮肤型狼疮发病机制的探讨。

3.2 狼疮皮肤病变与自身免疫密切相关

关于皮肤型狼疮发病机制的研究有很多。有文献指出，角质层释放促炎因子，作用于上皮细胞基底层，发生抗原抗体反应并促使角质细胞的凋亡，并释放免疫刺激的内源性核酸，通过相关炎症因子激活体内先天性免疫应答[14]，进而介导狼疮皮肤病变的形成。将狼疮患者血清中的抗dsDNA IgG抗体提取出后注射到C57BL/6小鼠皮下，引起了皮肤的炎症反应，证实狼疮血清抗dsDNA IgG与皮肤狼疮有着紧密关系[15]。IL-1也可能是狼疮皮肤病变的重要促炎因子[16]。免疫复合物沉积在皮肤也是导致狼疮皮肤受损的原因[17]。TH17参与了狼疮皮肤病变[18]。虽然自身抗体在狼疮中扮演着重要作用，但其在皮肤型狼疮发病机制中的作用目前尚不明确。本实验用狼疮小鼠皮肤病变部位进行病理检测，发现角质层的缺失及大量淋巴细胞浸润，进一步证实狼疮皮肤病变与自身免疫密切相关。

3.3 老龄TC小鼠是良好的慢性皮肤型狼疮的疾病模型

系统性红斑狼疮患者常有皮肤的受累，表现为颧骨两侧蝶形红斑、盘状红斑，并伴有脱发和光敏感，但发病原因未明，其主要原因在于目前尚未良好的模型来研究皮肤型红斑狼疮。皮肤型红斑狼疮根据临床表现及病程分为急性、亚急性和慢性皮肤型红斑狼疮。急性皮肤型红斑狼疮可能仅在多脏器受累前几周或者数月发生，常为短暂的和非瘢痕性的皮疹[19]。用17β雌二醇处理年轻雌性TC小鼠4周后即可诱导急性皮肤症状的发生，此时检测的TC小鼠血清抗dsDNA及抗ANA抗体均为阴性，符合急性皮肤型狼疮的临床表现。其皮肤病理结果显示上皮层缺失，但淋巴细胞浸润明显减少，发病机制有待进一步研究。

慢性皮肤型红斑狼疮好发于40 ～ 50岁的中老年女性，进展到最后出现不可逆转性瘢痕脱发。本研究通过长期观察对比和记录TC鼠皮肤受损情况，我们发现40周龄的TC小鼠中有66.6%出现典型的不可逆性皮肤受累症状，表现为颈部、背部、耳廓部的皮肤毛发脱失甚至溃烂，且随着周龄的增加病变区域逐渐增大，HE染色显示毛囊的减少甚至消失，这在既往相关研究中未曾报道过，而检测老龄TC小鼠血清抗dsDNA及抗ANA抗体为阳性，说明老龄TC小鼠是典型的系统性红斑狼疮小鼠，因此符合慢性皮肤型红斑狼疮的临床表现。此外，相关文献指出，TC小鼠20周龄即可产生高浓度的抗dsDNA抗体[20]，7个月左右可进展为严重的狼疮性肾炎[21]，但未有更大周龄的TC小鼠报道。我们推测，28周龄左右的TC小鼠由于表现出严重的狼疮性肾炎症状，可以满足对狼疮自身抗体、狼疮肾炎及淋巴细胞之间相互关系研究的需求，故多数研究无必要持续观察至40周，所以未发现TC小鼠有皮肤受累症状。本研究发现老龄的TC小鼠有脱毛和皮肤溃烂的症状，检测其体内抗dsDNA抗体和抗ANA抗体升高，证实该鼠为典型的狼疮疾病小鼠，通过皮肤病理检查结果，发现溃烂皮肤部位真皮层大量淋巴细胞浸润，表明皮肤病变的TC小鼠与自身免疫有着密切关系。综上，老龄TC小鼠作为典型的狼疮疾病小鼠，可作为一种新的慢性皮肤型红斑狼疮小鼠模型。