利用黑斑双鳍电鳐构建实验性自身免疫性重症肌无力小鼠模型

李志彬，李毅，金宛霖，杨树梅，孟环宇，胡波，徐立群，罗朝辉，杨欢

(中南大学湘雅医院神经内科，长沙 410008)

重症肌无力(myasthenia gravis, MG)是一种由于神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜主要以乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR)被自身抗体破坏，从而引发NMJ传递障碍而产生的自身免疫性疾病[1]。目前公认的经典MG动物模型是用加利福尼亚电鳐(Torpedocalifornica)电器官提取、纯化的AchR蛋白来主动免疫，建立实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)模型，进行MG发病机制研究。由于加利福尼亚电鳐以及用于纯化的眼镜蛇神经毒素难以获得，国内目前难以建立符合国际化的临床前实验标准的 EAMG动物模型[2]。我们参考国内外文献[3-4]，从黑斑双鳍电鳐的电器官提取、纯化的AchR蛋白作为抗原免疫容易致敏的C57BL/6小鼠，建立小鼠EAMG模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6 ～ 8周龄SPF级C57BL/6雌鼠40只，体重16～18g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK(湘) 2016-0002】，并饲养于中南大学实验动物学部屏障设施内【SYXK(湘) 2015-0017】。 饲养环境：室温22 ～ 25℃，湿度50% ～ 60%，昼夜各半交替。实验操作在中南大学实验动物学部屏障设施进行。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号: 201703106)。

1.1.2 实验试剂

免疫动物所需的AchR蛋白来自于我们实验室所提取。α-中华眼镜蛇神经毒素(上海科敏生物科技有限公司，中国)，氨甲酰胆碱(四川省奥克生物技术有限公司，中国)，H37Ra(BD公司，美国)，CFA(Sigma公司，美国)。

1.1.3 实验仪器

Millipore 3000超滤管浓缩(Millipore，德国)，透析带(上海鼎国生物技术有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 AchR的提取

黑斑双鳍电鳐(Narcinemaculate)(图1)从我国南海海域捕捞，剖取电器官，存于-80℃冰箱。将200 g冰冻的电器官与2倍体积的匀浆缓冲液倒入组织破碎机中，高速匀浆得到均质混合物，287 000 r/min，4℃离心30 min，弃上清液，取3倍于沉淀体积的匀浆缓冲液(含1%的Triton X-100溶液)，4℃低速振荡过夜。将振荡后混合物继续287 000 r/min，4℃离心30 min，得到含AchR的上清液。

图1 黑斑双鳍电鳐Figure 1 Gross image of a Nacrine maculate

1.2.2 中华眼镜蛇毒亲和层析柱制备及纯化AchR蛋白

(1)中华眼镜蛇毒亲和层析柱制备

将7.5 g冻干的活化CNBr交联凝胶加入30 mL浓度1 mmol/L的盐酸中，静置15 min，将凝胶与30 mg α-中华眼镜蛇神经毒素混合，测量A280吸光度检测二者混合状态。加入50 mL pH 8.0 的 0.2 mol/L 甘氨酸入凝胶，4℃过夜。依次用4 ～ 5倍量的耦合缓冲液、0.1 mol/L 的醋酸缓冲液(pH=4)/0.5 mol/L 氯化钠、耦合缓冲液冲洗凝胶，以去除未偶联的神经毒素，将其倒入1.5 × 20 cm Econo柱中，制备神经毒素凝胶柱子。

(2)制备羟基磷灰石柱子

将40 mL生物胶HT羟基磷灰石溶解于100 mL浓度为10 mmol/L Tris缓冲液，轻旋搅拌，静置5 min。小心倒出混合液上清中的悬浮细末及沉淀物上部的少许粉末。重复用100 mL浓度为10 mmol/L Tris缓冲液洗5次，将其倒入1.5 × 20 cm Econo柱中，制备羟基磷灰石柱子。

(3)亲和纯化AchR蛋白

用1.2.1得到的AchR的上清液与(1)得到的中华眼镜蛇神经毒素凝胶重悬混合，4℃低速振荡过夜。将振荡混合液重新装柱，制备AchR毒素亲和柱。用含有0.2%的胆酸钠缓冲液冲洗AchR毒素亲和柱以及羟基磷灰石柱子。用100 mL浓度为1 mol/L 氨甲酰胆碱缓冲液冲洗含有羟基磷灰石柱子。用塑料管连接两个柱子和Bio-Rad 蛋白纯化系统的蠕动泵。以60 mL/h的速度运行蠕动泵，循环14 ～ 16 h。用500 mL柱子冲洗液冲洗羟基磷灰石柱子，用洗脱缓冲液冲洗柱子，收集洗脱液。用millipore3000超滤管浓缩，装入截流范围3500的透析带，置于生理盐水中，4℃下每次透析8 h，更换生理盐水，共透析3次，得到纯化的AchR蛋白溶液。

1.2.3 SDS-PAGE分析

取AchR蛋白溶液，8%丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色呈现5个条带(图2)。利用BCA法测定纯化AchR蛋白浓度为1.8 mg/mL，从200 g湿电器官中共提取21 mg纯化AchR蛋白。

注：AchR纯化蛋白经8%SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色呈现5个条带。图2 AchR纯化蛋白电泳图Note. After electrophoresis of the purified AchR protein by 8% SDS-PAGE, Coomassie blue staining showed 5 Bands.Figure 2 Electrophoresis of the purified AchR protein

1.2.4 EAMG 模型制备及评价

(1)EAMG 模型制备

6 ～ 8周龄的 C57BL/6雌鼠， 40只，随机分为 2 组，佐剂组、模型组, 每组 20 只并编号。按每只模型组小鼠注射免疫原的剂量：20 μg AchR溶于100 μL PBS，与100 μL的含有10% (m/v) H37Ra的 CFA悬液完全乳化，共200 μL，上述乳剂以50 μL/只皮下注射四个部位，第一次免疫于双侧后足垫及双肩，第二、三次免疫于双大腿处及双肩。分别于实验第 1 天、第30天、第60天，共免疫 3 次，第70天结束观察，记录小鼠的临床评分、体重、新斯的明实验、肌电图等指标，然后处死动物测定血清中抗AchR抗体水平。通过上述指标测定，综合判定模型成功与否。

(2)EAMG评价及检测方法

临床评分：参照 Lennon等的[5]方法将肌无力严重程度分为四级；体重：每周记录小鼠一次体重；新斯的明实验：按每克体重给予新斯的明2.4×10-4mg肌肉注射，监测小鼠的临床评分；肌电图：按Wu 等[3]的方法；血清中抗AchR抗体：采用ELISA法测定血清抗AchR抗体总IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c[6]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 临床评分

模型组共有11只小鼠临床评分高于1分，第3～4周共有两只发病，余9只于第二次免疫后发病，其中2分5只，3分4只。佐剂组动作快，无隆起体位； 模型组发病小鼠表现为呼吸急促，头部震颤，行走缓慢，竖毛，隆起体位。两组之间临床评分比较，差异有显著性，P< 0.01(表1，图3)。

2.2 体重

动态监测小鼠体重，模型组于免疫接种第三周后食量减少，体重逐渐减轻，佐剂组体重逐渐增加。与佐剂组体重比较，模型组发病小鼠的体重明显减轻， 差异有显著性，P< 0.01(表1)。

表1 小鼠临床评分及体重Table 1 Clinical scores and body weight of the

注：与佐剂对照组比较，**P< 0.01。

Note. Compared with the adjuvant control group,**P< 0.01.

2.3 血清中抗AchR抗体

与佐剂组比较，血清抗AchR抗体总IgG、IgGl、IgG2b和IgG2c含量在EAMG 模型组发病小鼠中明显增高，差异有显著性，P< 0.01(表2)。

2.4 肌电图

与对照组比较，模型组发病小鼠在 3 Hz 低频电刺激下第五个反应幅度较第一个衰减显著大于10%(图4)。

2.5 新斯的明试验

取EAMG模型组发病小鼠，按每克体重给新斯的明2.4×10-4mg肌肉注射，5 min后小鼠症状出现明显改善，判定为新斯的明试验阳性。

图3 对照组(A)与模型组(B)小鼠Figure 3 Mice of the control (A) and model (B)groups

表2 小鼠血清anti-AchR ab不同亚型含量值)Table 2 Different subtypes of serum anti-AchR ab in the mice OD values)

注: 与佐剂对照组比较，**P< 0.01。

Note. Compared with the adjuvant control group,**P< 0.01.

图4 对照组(A)与模型组(B)小鼠肌电图Figure 4 Electromyogram of the mice in control group (A) and model group(B)

3 讨论

重症肌无力是一种位于神经肌肉接头处的，针对突触后膜不同成分，产生不同自身抗体的自身免疫性疾病，其中80%以上患者血清可检测到抗AchR抗体阳性[1]。为了探讨MG的发病机制及治疗方法，1973年 Lindstrom 等[7]从电鳗的电器官中提取AchR免疫兔子首次建立了AchR-EAMG模型。自Lindstrom的研究后，越来越多建模方法被应用到MG动物模型上。国内研究者也利用电鳗乙酰胆碱受体构建了重症肌无力小鼠模型[8]，除了使用AchR作为免疫原得到AchR-EAMG模型，随后研究者们又首次建立了Musk-EAMG模型[9]和LRP4-EAMG模型[10]。其中AchR-EAMG模型还包括利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体构建被动转移模型[11-12]，重组人AchR建立EAMG模型[13-14]以及人工合成 AchR 多肽构建 EAMG 模型[15]，其中最经典是利用T-AchR构建小鼠及大鼠的EAMG模型[3]。

自2015年美国NIH及MGFA重症肌无力临床前实验标准化指南发布以来，提取AchR用于构建符合国际化临床前标准的EAMG模型越来越受到科研人员的重视[2]。由于电鳐体内AchR含量高、易获取，因此Torpedo AchR(T-AchR) 成为制备EAMG 模型的最理想抗原，但国内难以获得T- AchR，且用于纯化的α银环蛇神经毒素价格昂贵。我们依据Wu等[3]经典方法并予以改进，从国产电鳐的电器官提取、纯化AchR蛋白。主要有以下几个方面的改进：首先，我们依照沈国光等的文献报道，选用容易得到的中国南海海域黑斑双鳍电鳐作为提取AchR的来源，有利于充分利用我国的自然资源；其次，在方法上，我们选用价格便宜且容易获得的国产30 mg α-中华眼镜蛇神经毒素即可构建达到较好效果的亲和层析柱，与并在亲和纯化AchR时，选用国产的氨甲酰胆碱，并运用超滤管浓缩和透析的方法，来获得纯化的蛋白。最后，我们从200 g湿电器官中得到21 mg 纯化AchR蛋白，这蛋白得率明显高于沈国光研究的蛋白得率,且本实验蛋白电泳图结果与其报道的AchR的电泳图有一定相似，但显示为5个条带，考虑国内外许多实验室报道的纯化受体蛋白电泳图各不相同，这可能与不同实验室所用的方法、条件不一有关。且很可能是不同实验室所用的AchR的种属来源不同，不同的受体来源，它们的亚基组成存在不同，多肽亚基的数目从1至4均有报道，但其中均含有一种分子量在40×103左右的亚基，例如Torpedo AchR的α亚基即由两个肽链构成，我们的AchR的电泳图中最下面两条带可能是同一亚基的两条肽链经电泳分离后的图像。之前也有研究验证该亚基可能是Ach的结合位点所在，在我们的电泳图中也存在一条分子量在40×103左右的亚基，这与其他实验室结果一致。

有关从这种国产黑斑双鳍电鳐中大量提取、纯化获得AchR，并用于构建C57BL/6 EAMG小鼠模型的研究在国内外尚未有报道。本实验用纯化的国产电鳐乙酰胆碱受体作为抗原免疫动物，成功建立了符合国际化的临床前实验标准的EAMG小鼠模型。该模型发病早且重，发生率达到50%以上，与经典的T- AchR造模接近。综合动物体内的各项指标发现，用纯化的AchR诱导EAMG模型，在发病机制、症状、电生理及免疫学改变方面与人 MG 十分相似。由此可见，这种方法造模效果好、原材料易获得、可行性强、较经济， 适合我国的国情，可用于批量造模、机制研究以及MG的临床前实验，适合 MG 具体发病机制、评估药物有效性及治疗机制等方面的研究。它对我国在EAMG的研究以及MG的临床前实验国际化认可方面将会产生积极意义。