脾气虚型兔视网膜脱离自动复位后视网膜电图的研究

张妍春 ，孙娟玲 ，任秀瑜 ，雷春灵 ，任美侠 ，曹爽 ，杨欣 ，李亚芙

孔源性视网膜脱离 （rhegmatogenous retinal detachment,RRD）是伴有严重的急性视力丧失的眼科疾病，即使脱离的视网膜成功复位，由于视网膜感光层变性及其引发的视网膜细胞和色素上皮细胞解剖结构重建的发生，患者往往会有永久性视功能损失[1-2]，视网膜电流图（Electroretinogram，ERG）检查表现为反应降低[3]。前期采用耗气破气加饥饱失常法建立脾气虚证以及在显微镜下行视网膜下注射透明质酸钠术建立RRD自动复位的证病结合动物模型进行系列研究[4-6]，证实脾气虚证对RD复位后视网膜三级神经元细胞结构的重塑均有不良影响，复位区域视网膜双极细胞层及节细胞层的病理改变更为严重且恢复缓慢，这将不利于复位后视网膜视功能的恢复。本文通过对实验性脾气虚证RRD复位后ERG的研究，进一步探讨脾气虚证对复位后视网膜功能恢复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年清洁级新西兰灰兔 （2.0~2.5 Kg）21只，雌雄不拘，经裂隙灯、眼底镜检查眼前节及眼底均无异常，实验动物及实验室均由第四军医大学动物实验中心提供。将21只实验兔随机分为3组，A组为空白对照组，B组为RRD自动复位组、C组为脾气虚型RRD自动复位组，A组兔3只，B组兔9只，C组9只，分别在实验开始时及建立RD自动复位模型手术后第 10 d、20 d、30 d，B、C组随机抽取 3只（6只眼）进行检查。

1.2 脾气虚证及RRD自动复位动物模型的制备

采用耗气破气加饥饱失常脾气虚证动物模型制备方式[7]，按照先前的方法制备脾气虚证兔模型[5]。C组兔于实验开始后隔日经胃管灌喂厚朴三物汤煎剂（厚朴、枳实、大黄按 3∶3∶2 比例混合制成，每 2 d 用药量12 g/Kg体重），喂药当日禁食，次日喂饲不限量。A、B组同时隔日经胃管灌喂生理盐水等量，实验期间给予正常饮食及饮水量。共持续42 d造脾气虚证动物模型。

RRD自动复位模型于脾气虚证动物模型造模开始后第22 d制备。按照先前的方法，B组及C组兔经玻璃体视网膜下注射0.2%的透明质酸钠造RRD自动复位动物模型[5,8]。

1.3 观察指标及测试方法

1.3.1 宏观指标及血清D-木糖检测方法 在造模和恢复过程中观测宏观症状体征指标包括兔子的精神，症状，大便及小便情况，活动度,舌象，肛温，食量等， 分别在 0 d、22 d、32 d、42 d、52 d 清晨喂食饲料前称量实验兔体重，喂食颗粒饲料（30 g/kg），2 h后抽取静脉血检测血清D-木糖。具体检测方法同先前的研究[5]。

1.3.2 眼底检查 于RRD模型造模后每天使用直接检眼镜观察并记录眼底视网膜脱离的范围、视网膜隆起的高度、裂孔大小、视网膜出血情况和玻璃体反应等情况至视网膜自动复位。复位后每周直接检眼镜检查玻璃体及视网膜1次。

1.3.3 F-ERG的检测方法 使用GT-2000NV多焦视觉电生理系统(国特医疗)，于术前，术后10 d、20 d、30 d在B、C组中各随机抽取3只 （6只眼）及A组3只（6只眼）进行F-ERG检测。具体方法：将新西兰灰兔用复方托品酰胺眼液散瞳3次后暗适应30 min，放入特制的固定兔架中，结膜囊内滴入0.5%地卡因表面麻醉，再滴入1%的甲基纤维素，置入角膜接触电极，参考电极和地电极采用自制的针电极植入额部正中皮下和耳缘皮下。将头部置于刺激球中央，遮盖一眼，单眼分别记录暗视反应（记录单次反应），暗视眼最大反应（记录单次反应），∑Ops，即振荡电位总和（叠加平均4次），单闪光视锥细胞反应（叠加平均10次）。

1.4 统计方法

选用SPSS13.0统计软件进行分析，经正态性检验后，符合正态分布者左右眼间比较采用t检验，组间比较采用多因素方差分析，不符合正态分布者采用秩和检验，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宏观指标

入组前3组兔全身宏观指标均未见明显异常，实验过程中A组及B组兔全身未见出现特殊情况，C组兔制备脾气虚证模型开始后1周全面出现纳食量减少、精神萎靡、蜷缩嗜卧、受惊时无神、软便、体重减轻等脾气虚证一般症状及体征，停止脾气虚造模因素后观察到该组兔软便、毛色灰白、体重减轻、精神倦怠等脾气虚证一般症及状体征持续至实验结束，A、B两组兔各时间点体重未见明显统计学差异，C组在各检查时间点体重较A、B组显著降低 （P＜0.05,图1A）。RRD制备术前C组兔D-木糖值明显降低，停止造气虚模型后有所恢复，但与A、B组相比，仍维持在较低水平（P＜0.05）（图 1B）。

2.2 眼底检查

术后第1 d观察所有实验眼屈光间质透明，B、C组下方视网膜灰白色隆起，鼻下方近赤道部视网膜裂孔，RRD维持5～9 d后视网膜自动复位，B组平均6.2 d，C 组平均 8.3 d。

2.3 闪光视网膜电图（F-ERG）检查

实验开始时随机抽取的9只兔18只眼ERG各波振幅、潜伏期（x¯±s）如表 1 所示，经统计学分析，除单次闪光视锥细胞a波b波振幅、单次闪光视锥细胞b波峰时及30 Hz闪烁光反应振幅等检测值外，其它检测值符合正态分布，对符合正态分布的检测值进行t检验及方差检验，不符合正态分布的进行秩和检验，结果显示左右眼及3组间均无统计学差异（P＞0.05）。

图1 3组动物体重及血清D-木糖值变化。1A体重；1B血清D-木糖值。 C 组与 B 组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

空白对照组、RRD自动复位组、脾气虚型RRD自动复位组不同时期ERG数据经统计学正态性检验，采用多因素方差分析对符合正态分布的ERG检测值进行比较，发现暗视ERG a波潜伏期、暗视ERG b波潜伏期，暗视ERG b波振幅，暗视∑OPs振幅等检测值在各实验组间差异有统计学意义，对以上数据进一步两两比较，结果如图2所示。暗视ERG a波潜伏期术后10 d，B、C组较A组均延长，比较有统计学意义。随复位时间延长B、C组暗视ERG a波潜伏期逐渐缩短，术后20 d、30 d与A组无统计学意义；暗视ERG b波潜伏期B、C组术后10 d,20 d较A组显著延长，随复位时间延长，B组潜伏时间缩短，术后30 d与A组无统计学差异，C组术后30 d暗视ERG b波潜伏期较A组、B组均显著延长；暗视ERG b波振幅术后各检查时间点B组与A组比较，无统计学差异，C组术后20 d、30 d较A组均明显下降，其中术后20 d较B组亦显著下降；∑OPs振幅B、C组术后10 d、20 d均与A组比较无明显统计学差异，C组至术后30 d较A组显著降低。采用秩和检验对不符合正态分布的ERG检测值进行比较，未发现组间有明显统计学差异。

表1 兔眼ERG初始数据（例数=18）

图 2 术后 F-ERG 各项目变化。2A 暗视 a波潜伏期（ms）；2B 暗视 b 波潜伏期（ms）；2C 暗视 b 波振幅(μV)，2D ∑OPs振幅(μV)。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

3 讨论

视网膜电图是视网膜受刺激时记录到的视网膜电反应总和，是一种无创伤性视功能检测方法，具有客观性，分层定位作用，能反映从光感受器到无长突细胞的视网膜各层细胞电活动，采用不同的刺激条件还可以分离视锥细胞和视杆细胞，是了解视功能最敏感的方法之一。常见波形为一个负相的a波和一个正相的b波，一般认为a波起源于光感受器内段(视细胞层),b波起源于Müller细胞或双极细胞(主要位于内核层)，OPs波（震荡电位）是附加在b波上的一系列节律性低振幅电位，代表视网膜内核层神经元抑制性反馈性突触环路的活动，可能起源于双极细胞或内丛状层细胞，与视网膜循环变化密切相关，它也是明视系统和暗视系统的混合反应。像中枢神经系统一样，视网膜有强大的细胞结构重塑能力，包括视杆细胞轴突回缩，水平细胞伸展，Müller细胞增殖及结构重组[9-10]。研究发现RRD患者视网膜成功复位后感光细胞外节基本能完全再生，并且与色素上皮层形成良好的连接，ERG功能随之恢复，但是如果外核层、外丛状层或内核层不能完全修复，ERG会有永久损伤[11]，因此，视网膜脱离与复位后视网膜结构的重建与视功能恢复有紧密的联系。

本实验通过对各实验组RD复位后不同时期进行ERG检查发现RRD自动复位组、脾气虚型RRD自动复位组视杆细胞感光层功能在术后视网膜复位早期受到影响，随时间延长逐渐恢复。RRD自动复位组术后复位早期视杆细胞、视锥细胞内层视网膜功能均受到明显影响，随复位时间的延长RRD组内层视网膜功能逐渐恢复，与以往文献报道相一致[12]。脾气虚型RRD自动复位组视杆细胞、视锥细胞内层视网膜功能明显较RRD自动复位组恢复缓慢，至术后30 d仍处于较低水平，与空白对照组差异显著。以上实验结果首次证实脾气虚证这一病理状态对RRD复位后Müller细胞和双极细胞、无长突细胞等视网膜内层细胞的功能恢复造成不利影响，而且涉及视锥细胞和视杆细胞，这与我们前期观察到的脾气虚证加重RRD复位后视网膜细胞的凋亡[13]，并对RD复位后视网膜双极细胞层及节细胞层的形态学影响更为严重且恢复缓慢的结论一致[4-6]，但是发生以上情况的具体原因有待进一步研究。提示临床应该注意患者全身证候可能对视网膜脱离复位后视功能恢复带来的影响。