益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠视网膜RGCs凋亡相关因子表达的影响

张兆康 ，倘孟莹 ，滕月 ，张丽霞

青光眼（glaucoma）是一种严重的致盲性眼病，视功能多呈进行性、不可逆性损害。目前认为青光眼的病理基础是视网膜神经节细胞 （retina ganglion cells，RGCs）的进行性丢失。大量的临床与基础研究表明，细胞凋亡是青光眼视神经节细胞丢失的主要途径[1-4]。细胞凋亡的发生、发展受多种基因调控，包括凋亡抑制基因和凋亡促进基因，Bcl-2和Bax分别是这两类基因中的典型代表。Caspase家族在细胞凋亡中也起着重要作用，Caspase-3属于凋亡效应亚类，直接促使细胞凋亡，被称为“死亡执行蛋白”。课题前期发现益精杞菊地黄颗粒剂对慢性高眼压大鼠RGCs的凋亡有明显的保护作用[5]，为了进一步探讨益精杞菊地黄颗粒抗RGCs的凋亡作用机制，应用免疫组织化学技术及Real Time-PCR检测技术观察益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响，为临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠7～8周龄60只,体重约 180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。“益精杞菊地黄颗粒”由枸杞子配方颗粒、菊花配方颗粒、熟地黄配方颗粒、山萸肉配方颗粒、泽泻配方颗粒、茯苓配方颗粒、黄芪配方颗粒等组成，由中国中医科学院眼科医院药剂科提供，加适量水溶解，无菌密封后放入4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药 将 “益精杞菊地黄颗粒”临床成人剂量（mg/kg）的 5倍、10倍、20倍，分别定为低剂量组、中剂量组、高剂量中药组，每组大鼠各12只，中药高、中、低剂量组分别给予不同浓度的颗粒剂灌胃给药。模型组与对照组给予等量的生理盐水灌胃。

1.2.2 高眼压动物模型的建立 根据烧灼巩膜上静脉法制成慢性高眼压模型[6-7]，术前左氧氟沙星眼药水冲洗眼部（右眼）消毒，于上睑中点做牵引缝线以拉开眼睑。在显微镜下，沿角膜缘外2 mm处行放射状的切口剪开外侧及上方球结膜，仔细分离筋膜和肌肉，可发现暴露鼻上、颞上和颞下象限2或3条巩膜上静脉，用眼科手术止血器烧灼这3支巩膜上静脉，烙闭成功的标志即烧灼处静脉血流消失，近端静脉充血怒张。术后用生理盐水冲洗结膜囊，平复球结膜，复方妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。大鼠的平均眼压在22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上者则为造模成功。

1.2.3 取材及标本制备 将大鼠过量麻醉处死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后视神经组织，4℃环境下4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋备免疫组化用。过量麻醉大鼠后，无菌条件下摘除大鼠眼球，自角膜缘剪开去除角膜、晶状体、玻璃体，取出视网膜，放入无RNAse的离心管中，立即置-80℃冰箱中冻存，备Real-Time PCR实验用。

1.3 检测方法

1.3.1 疫组织化学染色 石蜡切片常规脱腊至水化，进行抗原修复后脱水透明，中性树胶封片固定；光镜下分别观察大鼠RGCs中凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达情况,并利用Leica DM 2500显微镜Image-Pro Plus 6.0图像处理软件来进行图像采集和处理，每张切片随机取5个高倍视野照相，所得的平均光密度值作为Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的阳性表达水平。

1.3.2 Real Time-PCR检测 用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）进行反转录反应。以RNA模板进行RT-PCR定量检测，扩增程序为：95 ℃预变性 60 s，（95℃ 15 s，60 ℃60 s）×40个循环。采用2-△△ct方法进行数据的相对定量分析，△△ct=（实验组目的基因平均ct值-实验组内参基因平均ct值）-（对照组目的基因平均ct值-对照组内参基因平均ct值)。观察各组大鼠视网膜组织中 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 的表达。

表1 Bcl-2、Bax、Caspase-3 基因引物序列

1.4 统计学分析

所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，定量指标以均数±标准差（x¯±s）表示。 多组间的比较用完全随机设计的单因素方差分析（One-way ANOVA）。两组间的多重比较，采用LSD-t检验，各组与对照组或模型组的比较，采用Dunnett t检验(2-sided)。自身的前后对照比较用配对t检验,若P＜0.05，则认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色法检测各组大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白的表达

干预1个月后，空白组大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达较少，呈散在棕黄色颗粒状。模型组大鼠RGCs中Bcl-2略有表达，Bax、Caspase-3明显表达。中药中剂量组大鼠RGCs中Bcl-2明显表达，Bax、Caspase-3略有表达。中药高、中剂量组大鼠RGCs中Bcl-2表达多，Bax、Caspase-3表达少（表 2，图 1）。

各组大鼠RGCs中Bcl-2阳性表达平均IOD（平均积分光密度）值。与空白组相比，中药治疗组、模型组均有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，中剂量中药组的抗凋亡基因Bcl-2表达显著增多（P＜0.01），差异有统计学意义；而高、低剂量组 Bcl-2表达与模型组比较，无统计学意义（P＞0.05）。（表2，图 1）

各组大鼠RGCs中Bax阳性表达和平均IOD值和Caspase-3阳性表达平均IOD值。与空白组相比，中药治疗组、模型组Bax、Caspase-3表达均增多（P＜0.01），有统计学意义。与模型组相比，中剂量中药组促凋亡基因Bax、Caspase-3的表达显著减少（P＜0.01），差异有统计学意义；高、低剂量组 Bax、Caspase-3表达与模型组比较，无统计学意义（P＞0.05）。 （表 2，图 1）

2.2 各组大鼠视网膜组织中凋亡相关因子mRNA的相对表达量

表2 各组大鼠RGCs中凋亡相关因子IOD值比较（x¯±s，n=12）

图1 光学显微镜下各组大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达（免疫组化染色×40）

Bcl-2 mRNA：与空白组相比，中药治疗组、模型组均有显著性差异（P＜0.01），有统计学意义。与模型组相比，中药中剂量组、低剂量组的Bcl-2 mRNA相对表达量显著增多（P＜0.01），有显著保护作用；高剂量组Bcl-2 mRNA相对表达量与模型组比较无统计学意义（P＞0.05）。 （表 3，图 1）

表3 各组大鼠视网膜组织中凋亡相关因子mRNA的相对表达量比较（，n=6）

表3 各组大鼠视网膜组织中凋亡相关因子mRNA的相对表达量比较（，n=6）

注：*与模型组比较，表示P＜0.05；#与空白组比较，P＜0.05

组别 mRNA表达量Bcl-2 Bax Caspase-3空白组 0.593±0.083* 0.499±0.005* 0.641±0.047*模型组 1.126±0.203# 1.333±0.257# 1.503±0.029#高剂量中药组 1.333±0.086# 1.296±0.155# 1.429±0.047#中剂量中药组 2.026±0.161*# 0.960±0.072*# 1.123±0.015*#低剂量中药组 1.750±0.111*# 1.036±0.077*# 1.426±0.071#F 49.37 16.54 178.76 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

Bax mRNA：中药治疗组、模型组与空白组相比，均有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，中剂量中药组的Bax mRNA相对表达量显著减少 （P＜0.01），差异有统计学意义；低剂量中药组的Bax mRNA相对表达量减少（P＜0.05）;而高剂量组与模型组比较，无统计学意义（P＞0.05）。

Caspase-3 mRNA：中药治疗组、模型组与空白组相比，均有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，中剂量中药组的Caspase-3 mRNA相对表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；而高、低剂量组与模型组相比，无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 Bcl-2、Bax和Caspase-3在视网膜神经节细胞凋亡中的作用

细胞凋亡发生、发展受多种基因调控，目前认为与RGCs凋亡相关的基因中，以Bcl-2、Bax和Caspase-3最为典型[8]。Bcl-2家族包括抑制细胞凋亡的（Bcl-2，Bcl-xl等）和促进细胞凋亡的（Bax、Bad 等）两类蛋白亚群。Bcl-2基因，即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因，是比较重要的抗凋亡基因，而Bax可促进细胞凋亡，是典型的凋亡促进基因。Caspase家族在细胞凋亡中也起着重要作用，Caspase-3属于凋亡效应亚类，位于级联反应的下游，是凋亡途径的共同下游部分，直接促使细胞凋亡，被称为“死亡执行蛋白”。Bcl-2、Bax作为Caspase-3的上游调控机制，其表达能抑制各种因素所诱发的Caspase-3的激活和凋亡。在烧灼上巩膜静脉法诱导的慢性青光眼大鼠模型中发现[9]，模型眼较正常眼视网膜中Bcl-2蛋白的表达增多，治疗组较高眼压组Bcl-2表达显著增加，说明Bcl-2可能参与了青光眼RGCs凋亡及视神经保护的机制。

通过本实验表明，Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白在空白对照组RGCs中有少量表达；高眼压模型组和中药治疗组RGCs中bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达均较对照组增多；Bcl-2表达中药中剂量组较模型组显著性增加，Bax和Caspase-3蛋白的表达中药中剂量组较模型组显著性减少。因此我们选择bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达作为评价指标。Bcl-2在RGCs中的作用机制主要是通过抑制细胞色素C释放、下调细胞内的Ca2+水平、抑制星形胶质细胞的活化等保护视神经节细胞。而Bax可促使视神经轴突损伤，维持电压依赖性阴离子通道的开放使线粒体外膜完整性丢失。Caspase-3主要在凋亡诱导信号作用下，其效应被激活，水解细胞内靶物质，降解细胞内蛋白，则引起细胞凋亡。

3.2 探讨益精杞菊地黄颗粒对慢性高眼压大鼠RGCs的作用机制

益精杞菊地黄颗粒剂由杞菊地黄丸化裁而成。杞菊地黄丸源于《医级》，在经典方剂六味地黄丸的基础上加枸杞子、菊花而成，具有滋阴、养肝、明目之效。我们在前期研究中发现益精杞菊地黄颗粒在一定程度上可减少RGCs凋亡，对青光眼神经节细胞减少。同样RT-PCR法检测显示，中剂量组中药较模型组Bcl-2 mRNA的相对表达量显著增多，Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的相对表达量显著减少，均有统计学意义。值得注意的是，本实验中各用药组眼压轻度下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，益精杞菊地黄颗粒可能通过上调Bcl-2的表达，下调Bax、Caspase-3的表达，来发挥其保护RGCs的作用，并不是通过降低眼压来实现的。至于其确切机制是否与其他凋亡因子有关，还需进一步研究。由上所述，益精杞菊地黄颗粒通过调控基因蛋白，对抗视网膜神经节细胞的凋亡，从而保证视功能正常发挥。