儿茶素没食子酸酯对人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的机制研究

刘艳 ，张懿 ，雷锐 ，周海艳

年龄相关性黄斑变性 （Age-related macular degeneration，AMD）为老年人群视力减弱的主要病因之一。早期研究已证实视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化应激损伤与AMD的发生、发展关系密切[1-3]。当前在AMD治疗研究大多集中在抗氧化剂的药理活性上面，主要是对各种中成药的探讨，但对它们的作用效果及作用机制报道较少，于是寻找一种预防和治疗AMD的有效药物势在必行。儿茶素没食子酸（Epigallocatechin gallate，EGCG）是一种天然黄烷醇型活性化合物，具有抗氧化应激及抗炎性反应的药理活性[4-6]，而且研究发现其对人晶状体上皮细胞氧化应激损伤具有较好的药理活性[7]。肿瘤坏死因子相关受体因子6（TRAF6）属于胞内衔接蛋白，可以传导胞膜受体介导的胞外刺激信号，诱导下游TAK1介导的信号通路激活，导致氧化应激损伤的发生[8-9]。因此，本课题主要研究EGCG对人视网膜色素上皮 （ARPE-19）细胞氧化应激损伤的影响，并探讨其对介导氧化应激TRAF6/TAK1信号通路活化的影响，以期对AMD的治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

人视网膜色素上皮 （ARPE-19）细胞来源ARPE-19细胞购自武汉巴菲尔生物有限公司（来源于美国ATCC细胞库）。儿茶素没食子酸酯（成都普瑞法科技开发有限公司，批号：1257-08-5，纯度≥98%）；DMEM 培养基（美国 ScienCell公司）；胎牛血清 （美国Gibco公司）；胰蛋白酶购自美国Thermo scientific 公司（批号：R001100）；MDA、NO、SOD1 试剂盒购自北京智杰方远科技有限公司 （批号：TS-49350、TB-58260、BR-46250）；CCK8 试剂盒购自上海恒远公司（批号：ST-20059）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司 （批号：P0012AC）；兔抗大鼠 β-actin（货号 ab108267）、HO-1（货号 ab256745）、SOD1 （货号 ab203214）、TRAF6（货号 ab552260）、TAK1（货号 ab205628）及 p-TAK1（货号ab587415）一抗均购自英国Abcam公司；HRP标记山羊抗兔IgG二抗购自武汉谷歌生物有限公司。

1.2 仪器

仪器BIORAD-550型酶标仪（美国伯乐公司）；BBS-V800型单人超净台 （山东鑫贝西公司）；SPX-250型细胞培养箱 （美国Thermo公司）；GE-100型凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；双色红外激光成像系统（BIO-RAD，美国）；7230G数显可见紫外分光光度计测定仪（上海菁华）。

1.3 ARPE-19细胞培养

采用常规DMEM完全培养基 （10%的胎牛血清、1%的100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）培养，培养箱条件为37℃、5%CO2浓度，待细胞长满至90%左右时用PBS清洗后加入胰酶消化，显微镜下观察待细胞变圆后加入培养基终止消化，分装于3个培养瓶进行传代培养。

1.4 分组及药物处理

将细胞分为正常对照组、H2O2（100 μmol/L）诱导组、H2O2+低剂量（40 μmol/L）EGCG 组、H2O2+中剂量（80 μmol/L）EGCG 组、H2O2+高剂量（160 μmol/L）EGCG组，采用H2O2刺激细胞构建氧化应激损伤模型，同时加入EGCG干预细胞进行药物治疗，二者同时作用长达24 h后进行后续实验。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 CCK8法 将对数生长期细胞进行消化重悬接种于96孔板，待细胞贴壁后吸去旧培养基，按“1.4”项分组及药物处理24 h后吸去旧培养基，然后每孔加入10 μL CCK8试剂，继续放置培养箱中孵育1 h后，置于酶标仪中测定每孔细胞的吸光度OD值，检测波长设置为450 nm，并计算细胞存活率。细胞生存率（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.5.2 MDA、NO含量及SOD活性检测 取对数生长期的ARPE-19细胞，清洗、消化、重悬细胞后，取适量浓度细胞接种至6孔板中，每组实验设置6个复孔，37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。低、中、高剂量EGCG和H2O2共孵育细胞，加入含药物的终体积为2 mL/孔。药物作用24 h后，收集细胞裂解成匀浆液，按照试剂说明书测定MDA、NO含量及SOD活性。

1.5.3 Western Blot将“1.5.2”项收集的细胞裂解制备成匀浆，离心收集上清提取细胞蛋白。BCA法测定细胞总蛋白浓度。各孔取50 μg的蛋白上样，于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离 （浓缩胶70 mV电压，40 min；分离胶120 mV电压，90 min）。将分离后的蛋白电转移 （275 mA电流，90 min）至PVDF膜。加入5%脱脂奶粉封闭液于摇床上室温封闭1h。用TBST洗膜3次，每次8 min，分别加入HO-1、SOD1、TRAF6、TAK1 及 p-TAK1 抗体（体积稀释比例均为1:1000）4℃反应过夜。次日先以TBST洗膜3次，每次10 min。后加入HRP标记的山羊抗兔IgG（体积稀释比例为1:3000），室温反应1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL试剂盒说明进行显影。采用双色红外激光成像系统对蛋白条带灰度值进行分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x¯±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验，若P＜0.05，则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对ARPE-19细胞增殖的影响

与正常对照组比较，H2O2诱导组中细胞增殖受到明显抑制（P＜0.05）；与 H2O2诱导组比较，各剂量 EGCG组细胞相对存活率明显升高，差异均有显著性（P＜0.05），并且随着EGCG剂量的增加，细胞相对存活率也随着增高，呈现出浓度依赖性（F=10.326，P＜0.05）（图 1）。

图1 不同组间ARPE-19细胞增殖情况比较。1正常对照组；2 H2O2诱导组；3 H2O2+低剂量EGCG组；4 H2O2+中剂量EGCG组；5 H2O2+高剂量EGCG组。*与正常对照组比较，P＜0.05；#与H2O2诱导组比较，P＜0.05。

2.2 EGCG对ARPE-19细胞匀浆氧化应激产物水平的影响

与正常对照组比较，H2O2诱导组中细胞匀浆MDA及NO水平明显升高，SOD1活性显著降低（P＜0.05）；与H2O2诱导组比较，各剂量EGCG组细胞匀浆MDA及NO水平明显降低，而SOD1活性明显升高，差异均有显著性（P＜0.05），并且随着EGCG剂量的增加，细胞匀浆MDA及NO水平随着降低、SOD1活性随之升高，表现出浓度依赖性 （F值分别为6.357、14.361、10.326，P 值均＜0.05）（表 1）。

表1 EGCG对ARPE-19细胞氧化应激产物水平的影响（x¯±s）

2.3 EGCG对ARPE-19细胞中HO-1及SOD1表达的影响

与正常对照组比较，H2O2诱导组中HO-1及SOD1表达水平明显降低（P＜0.05）；与 H2O2诱导组比较，各剂量EGCG组细胞HO-1及SOD1表达水平明显升高，差异均有显著性（P＜0.05），并且随着EGCG剂量的增加，细胞HO-1及SOD1表达水平而随着升高，表现出浓度依赖性 （F值分别为11.035、8.361，P 值均＜0.05）（图 2）。

图2 不同组间HO-1及SOD1蛋白表达比较。1正常对照组；2 H2O2诱导组；3 H2O2+低剂量EGCG组；4 H2O2+中剂量EGCG组；5 H2O2+高剂量EGCG组。2A HO-1蛋白表达；2B SOD1蛋白表达。*与正常对照组比较，P＜0.05；# 与 H2O2诱导组比较，P＜0.05。

2.4 EGCG对ARPE-19细胞中TRAF6/TAK1信号通路的影响

与正常对照组比较，诱导组中TRAF6表达及TAK1磷酸化水平明显升高（P＜0.05）；与 H2O2诱导组比较，各剂量EGCG组细胞TRAF6表达及TAK1磷酸化水平明显降低，差异均有显著性（P＜0.05），并且随着EGCG剂量的增加，细胞TRAF6表达及TAK1磷酸化水平而随着降低，表现出浓度依赖性（F值分别为 5.395、7.039，10.326，P 值均＜0.05）（图 3）。

图3 不同组间TRAF6及p-TAK1蛋白表达比较。1正常对照组；2 H2O2诱导组；3 H2O2+低剂量EGCG组；4 H2O2+中剂量 EGCG组；5 H2O2+高剂量EGCG组。3A TRAF6蛋白表达；3B p-TAK1蛋白表达。* 与正常对照组比较，P＜0.05；# 与H2O2诱导组比较，P＜0.05。

3 讨论

AMD的病原学及发病机制尚未阐明，当前研究证实细胞老化、氧化应激损伤、炎性免疫、血管生成和抑制因子上调等因素均会诱发AMD的发生[10]。伴随着年龄的增长，机体抗氧化能力也随之减弱，视网膜色素上皮细胞介于脉络膜毛细血管层及光感受器细胞层之间，容易引起机体氧自由基的攻击，进一步引发AMD等视网膜病变的发生。研究发现AMD发病早期便会出现视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤，并常伴随该细胞凋亡的出现[11]。

视网膜色素上皮细胞发生氧化损伤的细胞器为线粒体，而损伤的严重程度由活性氧的水平决定，后者可介导该细胞凋亡的发生，进一步参与视网膜色素细胞屏障功能的损伤。体外研究发现，氧化应激损伤能够导致视网膜色素上皮细胞发生凋亡，这可能为AMD早期该细胞发生凋亡的其中一个原因[12]。H2O2属于一种极易透过细胞膜的强氧化剂，通过增加细胞内活性氧水平导致细胞氧化损伤的作用[13]。

EGCG作为绿茶的主要活性成分之一有着显著的抗肿瘤功效，能通过介导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞分裂周期、调节相关信号通路活性、降低癌细胞侵袭及转移等来起到抑制肿瘤的作用[14]；除此之外，EGCG已被证实在抗氧化应激等方面也起着较好的药理作用[15]。然而EGCG对视网膜色素上皮细胞的保护作用研究未见报道，于是本研究采用活性氧形式之一的H2O2作用ARPE-19细胞，引起该细胞的氧化应激损伤，探讨EGCG对ARPE-19细胞的保护作用。

本实验研究发现，本文采用H2O2体外诱导ARPE-19细胞氧化损伤模型，发现H2O2诱导组细胞相对存活率明显降低，细胞匀浆中氧化应激产物MDA、NO水平升高、而SOD1酶活性降低，细胞中HO-1、SOD1蛋白表达显著降低，说明实验中构建的ARPE-19氧化损伤细胞模型成功。接着采用低、中、高剂量EGCG干预细胞后发现，EGCG可明显抑制ARPE-19细胞匀浆中氧化应激产物MDA、NO水平，而能诱导SOD1酶活性及水平的上升，进而诱导ARPE-19细胞增殖能力的升高。提示EGCG对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞的氧化损伤具有保护作用。

胞内衔接蛋白TRAF6活化后可在TAB-1及TAB-2介导下，与MAP3K家族成员TAK1结合并将其激活，后者可进一步激活氧化应激信号通路[16]。研究已提出TRAF6/TAK1信号通路可参与氧化应激损伤，进而抑制了抗氧化酶HO-1、SOD1表达，诱导了氧化应激产物MDA、NO的产生[17]。研究还发现EGCG可通过抑制TRAF6信号传导进而降低黑色素瘤细胞的增殖[18]。本实验发现采用低、中、高剂量EGCG干预ARPE-19细胞后，TRAF6表达及p-TAK1水平明显降低，说明EGCG能抑制氧化损伤的ARPE-19细胞中TRAF6/TAK1信号通路的活化，从而降低氧化应激损伤。综上所述，研究结果表明H2O2可以成功的诱导ARPE-19细胞氧化损伤模型，EGCG干预后能明显降低氧化应激产物的产生，提示EGCG对AMD具有保护作用，这种保护作用可能与抑制TRAF6/TAK1信号通路活化有关。