补肾活血中药对早期糖尿病大鼠视网膜内屏障损伤的影响

王笃亲 ，谢学军 ，万李 ，张梅 ，羊洁 ，秦学维

糖尿病视网膜病变 (diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者并发症中最为常见的一种微血管病变,是目前常见的致盲性眼病之一，而对DR的发病机制尚存争论，近几年国内外围绕DR的影响因素展开了较为深入的研究，目前普遍认为糖基化终末产物[1]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）[2]、蛋白激酶C活化[3]等均与DR发生有着密切关系。而血-视网膜屏障(Blood-retinal barrier，BRB)受损是DR产生的病理基础之一[4]。目前倾向认为糖尿病患者的BRB出现障碍与血-视网膜内屏障（internal blood-retinal barrier，iBRB）的损害有着密切联系[5]。中医药防治DR一直是中医眼科领域热点，本研究将iBRB作为研究链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）引起早期糖尿病大鼠出现视网膜水肿的重要靶点，同时观察补肾活血中药对早期糖尿病大鼠iBRB损害的干预作用及机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采用大鼠体质量在200～250 g之间的SD大鼠150只（成都中医药大学动物实验中心提供，标准号为清洁级），雌雄各75只。实验室室温设置在18～28℃之间，相对湿度为40%～70%。以上实验动物及其饲养环境标准均符合国家医用研究动物的使用标准。

1.2 主要试剂、药物与仪器

试剂：罗丹明 B 及 Tris-base（Sigma Aldrich，美国），胰蛋白酶（Gibco，美国），HE 染色试剂盒、4%多聚甲醛（翊圣生物科技，上海），PBS粉末、柠檬酸缓冲液（海标科技，厦门），STZ（Sigma Aldrich，美国）。

仪器：血糖试纸（稳豪型，上海强生公司），血糖仪（稳豪倍易型，上海强生公司）。荧光显微镜（尼康50i型，日本），超纯水系统（Merck Millipore，上海），离心机（Kendro Herzeus varifuge 3.0RS 型，美国），5%CO2恒温培养箱（Fermentas，美国），显微镜数码照相系统（OlympusSZX16，苏州），超净工作台、显微手术器械（艾研生物科技，上海），体式解剖显微镜（艾研生物科技，上海），针芯式滤器(MilliporeФ0.22μm，美国)。

补肾活血中药组成：本实验所用补肾活血中药复方由干地黄、丹参、人参、葛根组成，由成都中医药大学药学院提供。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 通过随机数字表法将成功造模的糖尿病SD大鼠分为5组，分别为模型组（阴性对照组）、阳性对照组、补肾活血中药高剂量组、中剂量组及低剂量组。另设1组正常对照组，选取同龄SD大鼠，每组24只（雌雄不拘），与患糖尿病SD大鼠相同饲料方法喂养。阳性对照组使用羟苯磺酸钙片临床常用量的10倍混悬液药量进行灌胃，高剂量中药组使用补肾活血中药临床常用量的20倍等容积混悬液药量进行灌胃，中剂量组采用10倍等容积药量，低剂量组采用5倍等容积药量，正常对照组和模型组采用相同容积量的羟甲基纤维素灌胃。将6组大鼠按照随机数字法分为4个时间亚组，包括各组灌胃后的1周亚组、2周亚组、4周亚组及8周亚组，每个亚组都有至少4只大鼠。

观察期间，模型组、阳性对照组、补肾活血中药高剂量组、中剂量组及低剂量组糖尿病大鼠持续使用高脂高糖饮食进行喂养。灌胃后的1周、2周、4周、8周时取相应时间亚组大鼠的视网膜，行消化酶血管铺片、HE染色、糖原染色，并且通过对RHIC的检测评估大鼠血-视网膜屏障的渗漏情况。

1.3.2 糖尿病大鼠造模方法 对SD大鼠进行造模，环境为标准实验动物房，每只笼子内饲养3只大鼠，所有大鼠均自由饮水，并使用高脂高糖饮食持续喂养1个月。糖尿病组SD大鼠禁食水12 h后腹腔注射 STZ 40 mg/Kg，并且用浓度 0.1 mmol/L、pH=4.5的柠檬酸钠缓冲液进行缓冲。72 h后在安静环境下从大鼠尾静脉取静脉取血，测定SD大鼠的血糖值。血糖浓度＞11 mmol/L设为患糖尿病病鼠，3 d后检测血糖并剔除血糖不达标的大鼠，血糖水平符合标准的糖尿病SD大鼠，每周测一次血糖及体重。

1.3.3 视网膜取材方法 大鼠进行灌注,固定和取材,方法如下:（1）3%戊巴比妥钠动物腹腔注射麻醉。（2）沿腹正中线切开胸腹壁,暴露心脏。 （3）18号钝针头插入左心室,剪开右心耳,同时打开双腔管的生理盐水端,灌注10～15 min直到从右心耳流出的液体变清亮后改为4%多聚甲醛灌注约20O ml。（4）完整取出眼球在放入2%多聚甲醛液中继续固定12 h。（5）将眼球做成眼杯，小心取出完整视网膜。显微镜下观察视网膜血管形态学的变化。

1.3.4 罗丹明(RHIC)法检测血视网膜屏障渗漏 （1）每只大鼠一次性腹腔注射罗丹明5 μl(剂量:1%RHIC/g体重,用无菌生理盐水溶解,用前配制)。（2）注射完毕后,将大鼠送回笼子,自由摄取食物和水,避光。（3）在罗丹明注射6 h后,对大鼠进行灌装取材，方法同前。（4）次日,行眼球冠状冰冻切片,切片厚10μm切片贴附于明胶包被的载玻片上,放置于空气中干燥，避光保存于-20℃冰柜中。（5）-20℃冰柜中取出切片室温下避光放置30 min。（6）4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核,防荧光淬灭剂封片,显微镜下拍片观察视网膜各层RHIC的渗漏情况。

1.4 观察指标

视网膜形态学改变：显微镜下观察不同组大鼠视网膜血管形态学的变化。

血视网膜屏障渗漏情况：显微镜下拍片观察各组中大鼠视网膜各层RHIC的渗漏情况

2 结果

2.1 大鼠视网膜血管的形态学变化

正常对照组：低倍镜下可观察到血管网较为完整，视神经乳头周边动、静脉及毛细血管网较为明显，动脉主干染色明显、静脉染色浅，动脉主干直径细，而静脉管径相对较粗。动脉周围血管网显著少于静脉。后极部的毛细血管网排列较为致密，周边部的毛细血管网呈放射状分布。采用高倍镜进行进一步观察：周细胞核小，染色深；内皮细胞核较大，染色浅，两细胞存在比例相同（图1A）。

与正常对照组各时间亚组大鼠的视网膜血管形态学相比较，模型组、阳性对照组、补肾活血中药高、中、低剂量组中的1周亚组、2周亚组、4周亚组及8周亚组大鼠的视网膜的血管形态均未见明显差异（图 1B）。

图1 大鼠视网膜血管形态学变化 （×40）1A正常组大鼠；1B补肾活血中药低剂量组

2.2 大鼠血-视网膜屏障渗漏的情况

正常对照组：大鼠各周亚组中视网膜各层均未出现RHIC渗漏的情况。

比较各组2周亚组,阳性对照组、补肾活血中药高剂量组、中剂量组及低剂量组、模型组均可见RHIC渗漏出现在外丛状层、内核层、内丛状层、神经节细胞层和神经纤维层，其中以模型组RHIC渗漏最多，补肾活血中药中、高剂量组RHIC渗漏情况相近且仅次于模型组，补肾活血中药低剂量组RHIC渗漏量低于中、高剂量组，阳性对照组RHIC渗漏最少。各组大鼠第4周亚组RHIC渗漏比第2周亚组RHIC渗漏更加显著，外丛状层、内核层、内丛状层、神经节细胞层和神经纤维层各层均有RHIC渗漏，其中以模型组RHIC渗漏最多，补肾活血中药中、高剂量组RHIC渗漏情况相近且仅次于模型组，补肾活血中药低剂量组RHIC渗漏量低于补肾活血中药中、高剂量组，阳性对照组RHIC渗漏最少。各组大鼠第8周亚组RHIC渗漏较第4周亚组RHIC渗漏更加明显：其中以模型组RHIC渗漏最多，补肾活血中药中、高剂量组RHIC渗漏情况相近且仅次于模型组，补肾活血中药低剂量组RHIC渗漏量低于补肾活血中药中、高剂量组，阳性对照组RHIC渗漏最少。（图2中A-F）

图2 各组第8周大鼠血-视网膜屏障渗漏光学显微镜图（×40）。2A 正常对照组（箭头所指无渗漏区）；2B模型组 （箭头所指RHIC渗漏区域为红色）；2C阳性对照组（箭头所指无渗漏区）；2D 补肾活血中药低剂量组；2E补肾活血中药中剂量组；2F补肾活血中药高剂量组。RHIC：罗丹明

3 讨论

3.1 糖尿病视网膜血管形态学改变的意义

糖尿病早期视网膜血管形态学的病理学改变是周细胞减少至消失和微血管瘤形成，视网膜毛细血管周细胞数量的减少的同时会降低糖尿病患者血-视网膜屏障作用，又反而加速了视网膜微血管瘤和新生血管的形成，进一步导致周细胞数量的下降，造成恶性循环[6]。

本研究选用啮齿类动物-大鼠，所有糖尿病大鼠模型均通过高脂高盐饮食和STZ诱导建立糖尿病模型,主要由于相同病因机制情况下，啮齿类动物最先出现周细胞的缺失[7],导致血管通透性的增加，这与人类在该病的发病机制有相似之处[8]。本研究血管铺片结果显示，正常对照组大鼠的视网膜血管网完整，在视网膜后极部的血管网排列尤为致密，视网膜周边部血管网呈发散分布。本研究发现模型组、补肾活血中药高、中、低剂量组、阳性对照组中各组的1周亚组、2周亚组、4周亚组、8周亚组与正常对照组各时间亚组视网膜血管形态学比较均无明显差异。国内外对此现象研究报道较为充分：国外有学者研究证实[9]糖尿病发生后，对于Lewis及Wistar大鼠都有神经节细胞丢失现象的发生，但SD大鼠则未见改变[10]。施沃栋等[11]的研究显示，成功建立糖尿病动物模型实验且病程1个月及以上的大鼠，其视网膜的厚度均已可见明显降低；病理学基础变化主要表现为视神经元的变性或凋亡，但无微血管瘤的发现。但与患有糖尿病大鼠不同的是，临床发现早期糖尿病患者，无法运用现有医学检查手段发现患者内层视网膜厚度的改变。另有研究显示，患糖尿病2周后，患者可出现视网膜功能的改变，iBRB开始逐步受累、功能障碍[12-13]。

3.2 糖尿病血-视网膜内屏障损伤

血-视网膜屏障损伤是导致非增殖型糖尿病性视网膜病向增殖型糖尿病性视网膜病转变尤为关键的因素，同时也是非增殖型糖尿病性视网膜病的显著病理学特征，临床上通过减轻或抑制非增殖型糖尿病性视网膜病患者血-视网膜屏障损伤，可以起到糖尿病视网膜病变的早期防治。

本研究结果显示：早期糖尿病大鼠外丛状层至神经纤维层都存在RHIC渗漏，而外层视网膜并未发现渗漏。采用中药补肾活血复方后，可以有效减少RHIC的渗漏，从而缓解iBRB功能被损害，进而缓解模型大鼠视网膜水肿症状。导致血管渗漏的重要结构基础是视网膜毛细血管内皮细胞及其周围细胞基质的损害。VEGF是血管生长因子大家族的重要成员，1994年有研究首次报道了关于其在糖尿病视网膜血管病中的重要性。临床研究表明：糖尿病视网膜病变患者增殖期糖尿病视网膜病变患者房水和玻璃体中VEGF的高表达[14]，而临床对于非增殖期的研究病例较难获得，研究较少，因此需要通过理论依据建造动物模型进行研究支撑。iBRB损伤和视网膜毛细血管内皮细胞和周细胞数量减少引发视网膜血管通透性增加是患者在非增殖期糖尿病视网膜病变视力丧失的另一原因。国内外相关[15]研究表明，高脂高糖饮食和STZ诱导的SD大鼠糖尿病模型，在SD大鼠糖尿病发病后10 d，即可出现视网膜通透性增高；而在DM BN大鼠发病后10 d，可出现连续性的视网膜血管渗漏，说明了遗传差异与大鼠种属类别无关，反而可能与糖尿病iBRB破坏的易感性改变密切关联。有研究在成年患糖尿病的灵长类动物的玻璃体内注入外源性VEGF，可出现非增殖期视网膜病变的眼底改变，并且这种糖尿病视网膜病变灵长类动物的眼底变化程度与外源性VEGF注射量呈正相关，表明VEGF在糖尿病的非增殖期病变中也存在相应的影响机制，新生血管的生成、i-BRB破坏等与VEGF密切相关[16]。李艳等[17]实验研究结果表明，患糖尿病后第2周的SD大鼠，其静脉血VEGF含量显著增高，且iBRB损伤明显，表明VEGF生长因子具有的血管通透性较强，而导致视网膜血管渗漏加重。糖尿病的病程如不积极进行控制，随着病程的延长，则会导致并加重iBRB损伤和视网膜血管内皮细胞和色素上皮细胞的形态和功能的改变。

本研究结果表明糖尿病视网膜病变的早期防治应作为临床治疗的关键,需要定期进行眼底造影及实验室检查。早期注重改善患者微血管循环，降低或阻止视网膜微血管细胞的丧失和功能降低，从而能够阻止或减少糖尿病视网膜病变患者无细胞性微血管的形成。