HMGA2在胃癌细胞上皮-间充质转化中的作用*

符 亮， 潘 锐， 陈 钊

(三亚市人民医院消化内科， 海南 三亚 572000)

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康和生存质量。临床上，胃癌转移是导致胃癌患者治疗失败和不良预后的主要因素之一[1]。近年来的研究证实，上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)参与多种肿瘤的转移过程，肿瘤细胞发生EMT的典型特点是上皮细胞表型缺失，其上皮标志蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)的表达降低，失去极性，并且表现出间质细胞的特性，间质标志蛋白神经型钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达增加[2]。

高迁移率族蛋白(high-mobility group protein，HMG)是在真核生物中广泛存在的一类染色质相关蛋白，主要包括HMGA、HMGB和HMGN家族成员。HMGA2是HMGA家族成员之一，在胚胎期及分化程度低的组织中大量表达，而在分化程度高的组织中几乎不表达[3]。在胃癌组织中，HMGA2呈现高表达状态，并且与胃癌患者的不良预后密切相关[4-5]，但具体机制尚有待进一步探讨。本研究探讨胃癌细胞EMT过程中，HMGA2的作用及可能机制。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌细胞株MKN45(低分化)、MKN28(高分化)和SGC7901(中分化)以及人永生化胃黏膜上皮细胞株GES-1购自中国上海科学院细胞库；脂质体Lipofectamine®3000(Invitrogen)；HMGA2 siRNA(si-HMGA2)和siRNA阳性对照(siRNA negative control,si-NC)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；TRIzol(Thermo)；RNA提取试剂盒(Invitrogen)；紫外分光光度计(Thermo)；逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；RT-qPCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；定量PCR扩增仪(ABI 7500，Applied Biosystems)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)；兔抗人HMGA2多克隆抗体(ab97276)、兔抗人E-cadherin单克隆抗体(ab11512)、兔抗人vimentin多克隆抗体(ab92547)和兔抗人N-cadherin单克隆抗体(ab18203)均购自Abcam；兔抗人GAPDH单克隆抗体(sc-367714，Santa)； HRP标记的羊抗鼠 II 抗(上海英基生物科技有限公司)；CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)；ECL发光液(Millipore)。凝胶成像仪(GelDoc-It，UVP)；显微镜(BX61，Olympus)。

2 方法

2.1细胞培养 4种细胞株均培养于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基中(青霉素1×105U/L，链霉素100 mg/L)，37 ℃、5% CO2条件下中培养，细胞融合度值80%～90%时，进行消化传代。

2.2脂质体转染 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增HMGA2基因编码区(NM_001300918.1)，BamH I和EcoR I酶切后，插入pcDNA3.0真核表达载体，经酶切、PCR和测序鉴定，构建pcDNA3.0-HMGA2表达载体。取4×105个处于对数生长期的MKN28细胞，接种于3.5 cm培养皿中，24 h后，采用脂质体Lipofectamine®3000将pcDNA3.0-HMGA2及空载体对照pcDNA3.0-empty分别转染至MKN28细胞中，操作步骤参照试剂说明书。

取4×105个处于对数生长期的MKN45细胞，接种于3.5 cm培养皿中，24 h后，采用脂质体Lipofectamine®3000将si-HMGA2(见表1)及si-NC(阴性对照组)分别转染至MKN45细胞中，操作步骤参照试剂说明书。

2.3RT-qPCR实验 收集1×105细胞，各细胞样品中加入1 mL TRIzol，抽提细胞总RNA，按照RNA提取试剂盒的说明书操作。紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度(A260/A280)，逆转录试剂盒进行逆转录。HMGA2、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1及内参照GAPDH的RT-qPCR引物序列见表1。定量PCR扩增仪检测各目的基因的mRNA表达水平。qPCR扩增体系为10 μL，反应条件为:50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，进行35个循环。采用2-ΔΔCt方法表示各目的基因的相对表达量，实验重复3次后，进行统计分析。

表1 si-HMGA2序列及RT-qPCR引物序列

2.4Western blot实验 收集(2～5)×105个细胞，加入RIPA蛋白裂解液，抽提细胞全蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白后，湿转法将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温震荡封闭1 h，TBS-T洗膜，加入Ⅰ抗[兔抗人HMGA2多克隆抗体(1 ∶1 000稀释)、兔抗人E-cadherin单克隆抗体(1 ∶1 000稀释)、兔抗人vimentin多克隆抗体(1 ∶1 000稀释)、兔抗人N-cadherin单克隆抗体(1∶1 000稀释)和兔抗人GAPDH单克隆抗体(1∶2 000稀释)]，4 ℃孵育过夜。TBS-T洗膜后，加入HRP标记的羊抗鼠II 抗(1 ∶10 000稀释)，室温孵育1 h，加ECL发光液进行化学发光显影，凝胶成像仪对蛋白条带进行观察，获取图像，并对图像进行灰度分析(Image Lab软件)，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。

2.5细胞划痕实验(would healing assay) 取对数生长期细胞(5～7)×105个，接种于6孔板中，24 h后，细胞汇合度达90%以上；使用移液器枪头，垂直于6孔板底部，均匀划线，每孔3条平行线；PBS洗涤3次，去除漂浮的细胞，加入无血清RPMI-1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中正常培养，分别于0 h和24 h时在显微镜下拍照，并计算细胞间距离。重复3次独立实验后，进行统计分析。

2.6细胞侵袭实验(Transwell assay) 24孔板中放置Transwell小室，在小室上层加入4.0 g/L Matrigel 50 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中过夜，使Matrigel凝固；在24孔板下室中加入500 μL的含10% FBS的RPMI-1640培养液，Transwell小室中加入100 μL的各实验组细胞悬液(细胞总数约1×105个)；48 h后，去除24孔板下室中的培养液，棉签擦去Transwell小室内室膜上的细胞，0.1%结晶紫溶液染色，室温5 min，显微镜下观察，每孔随机选取3个视野拍照，并记录每个视野的细胞数目。实验重复3次后，进行统计分析。

2.7细胞存活实验 处于对数生长期的各实验组细胞，接种于96孔板中，每孔接种(0.8～1)×104个细胞，设置3个复孔，继续培养48 h。弃去上清，加入CCK-8试剂，继续培养4 h，测定450 nm波长的吸光度(A)值。进行3次独立实验后，进行统计分析。

3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用经Bonferroni法校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 胃癌细胞和胃黏膜上皮细胞中HMGA2的表达水平

RT-qPCR和Western blot 结果显示，HMGA2在低分化的MKN45胃癌细胞中表达水平最高，而在永生化的GES-1胃黏膜上皮细胞中表达水平最低(P<0.05)，见图1。

2 转染效率的测定

RT-qPCR和Western blot结果显示，在MKN28细胞中，与空白对照(MKN28-control)组和空载体(MKN28-empty)组相比，HMGA2过表达(MKN28-HMGA2)组细胞中HMGA2的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)，而空白对照组和空载体组之间的差异无统计学显著性，见图2A、B。在MKN45细胞中，与空白对照(MKN45-control)组和阴性对照(MKN45-NC)组相比，HMGA2干扰(MKN45-si-HMGA2)组HMGA2的mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义，见图2C、D。

3 HMGA2表达水平对胃癌细胞活力的影响

CCK-8实验结果显示，与MKN28-control组和MKN28-empty组相比，MKN28-HMGA2组的细胞活力在第4天和第5天均显著下降(P<0.05)，见图3A；与此同时，与MKN45-control组和MKN45-NC组相比，MKN45-si-HMGA2组的细胞活力在第3天、第4天和第5天均显著增加(P<0.05)，见图3B。

Figure 1.The expression of HMGA2 at mRNA (A) and protein (B) levels in the gastric cancer cell lines and gastric epithelial cell line. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28, SGC7901 and GES-1 cells;#P<0.05vsMKN45, MKN28 and SGC7901 cells.

图1胃癌细胞和胃黏膜上皮细胞中HMGA2的表达水平

Figure 2.The transfection efficiency of liposomes in the MKN28 (A and B) and MKN45 cells (C and D). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group;#P<0.05vsMKN45-control group and MKU45-NC group.

图2脂质体转染MKN28及MKN45细胞的效率测定

Figure 3.The effects of HMGA2 up- or down-regulation on the viability of MKN28 cells (A) and MKN45 cells (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group;#P<0.05vsMKN45-control group and MKN45-NC group.

图3上调或下调HMGA2对MKN28和MKN45细胞活力的影响

4 HMGA2过表达对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响

划痕和侵袭小室实验结果显示，MKN28-HMGA2组的迁移和侵袭能力均显著高于空白对照组和空载体组(P<0.05)，见图4。

5 HMGA2对胃癌细胞EMT相关标志蛋白表达的影响

Western blot结果显示，MKN28-HMGA2组细胞中E-cadherin的蛋白表达量相对于MKN28-control组和MKN28-empty组均明显降低(P<0.05)，而N-cadherin及vimentin的蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);E-cadherin、N-cadherin及vimentin的蛋白表达水平在MKN28-control组和MKN28-empty组之间比较的差异无统计学显著性，见图5A。

在MKN45-si-HMGA2组的细胞中，E-cadherin蛋白的表达量相对于MKN45-control组和MKN45-NC组均明显增加(P<0.05)，而N-cadherin及vimentin蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)；E-cadherin、N-cadherin及vimentin蛋白表达水平在MKN45-control组和MKN28-NC组之间的差异无统计学显著性，见图5B。

6 HMGA2过表达对胃癌细胞Wnt/β-catenin通路相关分子mRNA表达的影响

RT-qPCR结果显示，β-catenin的mRNA相对表达水平在MKN28-control组和MKN28-empty组之间比较差异无统计学显著性，而MKN28-HMGA2组较这2组均明显增加(P<0.05)；MKN28-HMGA2组c-Myc的mRNA相对表达水平较MKN28-control组和MKN28-empty组有明显增加(P<0.05)，后2组之间比较差异无统计学显著性；MKN28-HMGA2组cyclin D1的mRNA相对表达水平较MKN28-control组和MKN28-empty组明显增加(P<0.05)，后2组之间比较差异无统计学显著性，见图6。

讨 论

胃癌是死亡率仅次于肝癌和肺癌的恶性肿瘤之一，我国每年新发胃癌病例数约占全球每年新发病例数的41%，且每年因胃癌死亡人数约占全球因胃癌死亡人数的35%[6]。目前临床上胃癌的治疗采用的是以手术为主，化疗、放疗、分子靶向治疗以及免疫治疗相结合的综合治疗方案。

EMT在多种生理病理过程中发挥着关键作用，如胚胎形成、伤口愈合以及肿瘤转移等[7]；此外，EMT在膀胱癌[8]和非小细胞肺癌[9]等多种肿瘤的转移中也发挥着极其重要的作用。上皮细胞发生EMT时，细胞失去极性，并出现间充质细胞的表型，表现出更强的移动性，然而诱导细胞发生EMT的具体分子机制仍未完全明确。HMGA2最早是在间充质来源的肿瘤中发现的[10]，作为一种转录因子，在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥作用，因此，HMGA2与肿瘤发生转移过程中的EMT有关。事实上，多项研究也证实了此观点，如HMGA2参与了前列腺癌[11]、乳腺癌[12]和直肠癌[13]等肿瘤的侵袭和转移。

本研究比较了不同分化程度的胃癌细胞和胃黏膜上皮细胞中HMGA2的表达水平，发现在低分化的胃癌MKN45细胞中，HMGA2的表达水平最高，而在永生化胃黏膜上皮GES-1细胞中，HMGA2表达水平最低。在MKN28细胞内过量表达HMGA2后，细胞的活力显著下降，而在MKN45细胞内干扰HMGA2的表达后，明显提高了细胞的活力。以上结果说明,HMGA2在胃癌细胞中可能参与了细胞生长的调控，并可能存在负相关的联系。进一步研究发现，HMGA2过量表达之后，MKN28细胞的迁移和侵袭能力显著增强，以上实验结果表明，HMGA2的高表达能够促进胃癌细胞发生迁移和侵袭。Zhang等[14]在舌癌中发现，过表达HMGA2能够通过EMT途径促进细胞发生迁移和侵袭。

Figure 4.The effects of HMGA2 over-expression on the migration (A, ×40) and invasion (B，×200) of MKN28 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group.

图4HMGA2过表达对MKN28细胞迁移和侵袭能力的影响

关于HMGA2是否参与胃癌细胞的EMT过程，本研究结果发现过表达HMGA2所诱导的标志蛋白的表达水平变换与EMT过程相一致，如上皮标志蛋白E-cadherin表达降低，间充质标志蛋白N-cadherin和vimentin表达增加；而在HMGA2表达被抑制后，E-cadherin表达增加，N-cadherin和vimentin表达降低。以上结果验证了本研究的推测，HMGA2参与并且促进了胃癌细胞的EMT过程。本研究结果还发现，在MKN28细胞中过表达HMGA2后，细胞内的Wnt/β-catenin信号通路被激活，即β-catenin及其下游分子c-Myc和cyclin D1的mRNA表达水平显著增加。而多项研究证实，Wnt/β-catenin信号通路的激活，能够促进细胞发生EMT，所以HMGA2可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路，诱导胃癌细胞发生EMT，从而促进了胃癌细胞的迁移和侵袭。本研究通过增加或抑制胃癌细胞中HMGA2表达，发现细胞中β-catenin、c-myc和cyclin D1发生相应变化，初步证实HMGA2参与调控Wnt/β-catenin信号转导通路中主要分子β-catenin以及下游靶分子c-Myc和cyclin D1表达，为HMGA2作为胃癌靶向治疗基因提供了依据。

Figure 5. The effects of HMGA2 up- or down-regulation on the expression of EMT-related proteins in MKN28 cells (A) and MKN45 cells (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group;#P<0.05vsMKN45-control group and MKN45-NC group.

图5上调或下调HMGA2对EMT标志蛋白表达的影响

Figure 6. The effects of HMGA2 over-expression on the mRNA expression of Wnt/β-catenin signal pathway-related molecules in the MKN28 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMKN28-control group and MKN28-empty group.

图6HMGA2过表达对Wnt/β-catenin信号通路相关分子mRNA表达的影响

综上所述，本研究结果证实，HMGA2在胃癌细胞中的高表达，能够促进细胞恶性表型的发生，即增强细胞的迁移和侵袭能力，并且HMGA2有可能是通过激活细胞内的Wnt/β-catenin信号通路，参与了胃癌细胞EMT的发生。本研究的局限性在于没有对Wnt/β-catenin信号通路的其他相关基因及下游基因进行检测，而且HMGA2是通过何种机制诱导激活Wnt/β-catenin信号通路，将在今后的研究中进一步探究。