4种固定液对甲状腺冷冻切片固定效果的比较

童康梅 郭国栋 黄海建 陈小岩

甲状腺疾病是临床中的常见病和多发病，治疗主要采用手术切除。一般均要求进行术中快速冷冻病理诊断，以确定肿瘤性质，有利于决定手术方式和手术范围，也可使患者免受二次手术的痛苦[1-3]。快速病理诊断要求时间短、诊断准确，冷冻切片是术中快速病理诊断的主要方法，冷冻切片技术在病理诊断中具有举足轻重的作用[4-6]，冷冻切片的质量将影响病理诊断的快速性和诊断性。甲状腺组织结构特殊，而影响甲状腺冷冻切片质量的因素众多，如取材，冷冻时间与温度，固定液，切片技术等，其中固定液的选择至关重要。下面选取4种不同的固定液来进行对比实验，通过HE染色观察4种固定液对甲状腺冷冻切片的固定效果，从而筛选出一种甲状腺冷冻切片的最佳固定液。

1 材料与方法

1.1 标本来源

福建省立医院南院病理科2017年5月—2018年5月新鲜甲状腺手术切除标本30例。

1.2 仪器及试剂

徕卡CM1950-1冷冻切片机，包埋剂OCT，Thermo MX35型一次性刀片，苏木精染液，1%盐酸乙醇分化液，0.5%氨水返蓝液，1%醇溶性伊红，各浓度梯度乙醇，二甲苯，中性树胶。

1.3 固定液

（1）95%乙醇；（2）10%中性缓冲福尔马林固定液；（3）AF液：95%乙醇90 mL，甲醛10 mL混合固定液；（4）AFA液：95%乙醇85 mL，甲醛10 mL，冰醋酸5 mL混合固定液。

1.4 方法

将徕卡CM1950-1冷冻切片机箱体温度设置为-18℃，冷冻切片机机头温度设置为-15℃，切片厚度6 µm，提前开启PE速冻台。送检新鲜甲状腺标本，规范取材，用滤纸将组织表面的血性液体吸干，然后将组织放入提前制备的OCT冰托上，再加盖少量包埋剂，用冷冻锤轻轻压平。粗修暴露最大面，然后6 µm厚连续切片4张，平整地吸附于洁净的载玻片上，分别迅速放入已准备好的4种固定液中固定1 min，稍水洗，入苏木素染色1 min，水洗；1%盐酸乙醇分化2 s，稍水洗；0.5%氨水返蓝，稍水洗；75%乙醇10 s，醇溶性伊红10 s，梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2 结果

经10%中性福尔马林固定的冷冻切片，组织结构模糊，核质对比度差，核固缩，核染色模糊，大部分胶质脱落（如图①、图⑤）。经95%乙醇固定的冷冻切片染色效果一般。组织结构尚清晰，核质对比度一般，胞核染色不佳，核明显收缩，滤泡胶质部分着色，部分胶质滤泡缺失（如图②、图⑥）。经AF液固定的冷冻切片，组织结构较清晰，核质对比度一般，核轻微收缩，胶质滤泡几乎全部着色（如图③、图⑦）。经AFA液固定的冷冻切片染色效果最好。组织结构清晰，颜色鲜艳，细胞核呈蓝色，细胞质呈淡粉色，细胞形态清晰，核质对比度良好，滤泡胶质全部着色，镜下最接近石蜡切片HE染色（如图④、图⑧）。具体详见图1。4种固定液对甲状腺冷冻切片固定效果的比较，详见表1。

表1 4种固定液对甲状腺冷冻切片固定效果的比较

图1 4种固定液对甲状腺冷冻切片效果的显微摄影比较

3 讨论

固定液具有渗透、杀死细胞及其微生物和固化组织等作用，是保存组织器官用于病理诊断所必需的过程；固定液保持离体组织细胞与生活时的形态相似，抑制组织自溶及细菌繁殖所致的腐烂；使细胞内一些蛋白质等可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原有部位，有利于固定后物质的确切定位；保持细胞内组织抗原、DNA、RNA，便于进一步的特殊检查；有利于染色反应，便于光镜下对细胞内不同成分进行区别[7]。甲状腺实质由大量甲状腺滤泡和滤泡旁细胞组成，滤泡间有少量结缔组织和丰富的毛细血管；甲状腺滤泡腔内充满透明的胶质，胶质是滤泡上皮细胞的分泌物，即碘化的甲状腺球蛋白，在切片上呈均质状，嗜酸性；胶质边缘常见空泡，是滤泡上皮细胞吞饮胶质所致。由于大多数甲状腺病变形态表现为滤泡结构，如甲状腺肿、甲状腺炎、腺瘤及甲状腺癌等，认识各种滤泡性病变，不仅有助于做出正确的病理诊断，而且能有机的与甲状腺功能相联系，全面解释患者的临床症状和体征，而选择最佳的固定液就能最大限度地缩小冷冻切片与常规石蜡切片的差异性[8-9]。甲状腺结构的特殊性决定了甲状腺在冷冻切片中对固定液选择和染色过程中条件选择的特殊性[10]。

甲醛为非沉淀性固定剂，不能使白蛋白和核蛋白沉淀，通过使蛋白质分子发生交联而产生作用[11]。甲醛水溶液渗透能力强，固定均匀，对组织收缩较少，10%中性福尔马林缓冲液可以很好的保存细胞核的形态结构，也能够较好地保存组织细胞的大多数抗原性，是一种最理想的常规固定液。但用10%中性福尔马林缓冲液固定冷冻切片时间长，需固定10 min以上[12]，由于甲状腺结构的特殊性，用10%中性福尔马林缓冲液仅短时间固定后，组织结构模糊，核质对比度差，核固缩，核染色模糊，胶质脱落现象明显，固不适合用于快速冰冻切片固定。

95%乙醇用于固定，对纤维蛋白和弹性纤维等固定效果好，其渗透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋白经沉淀后，能溶于水，不利于染色体的固定[11]，因此单纯用乙醇固定的组织其细胞核染色不佳，细胞收缩明显，且有胶质脱落现象，不适合单独用于快速冰冻切片的固定。

冰醋酸的穿透能力强，不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白，可较好地保存染色体的结构，能清楚地显示细胞核，缺点是组织膨胀较明显，尤其对胶原纤维和纤维蛋白，一般很少单独使用[12]。

AF液由95%乙醇，浓甲醛混合配制而成，甲醛固定作用均匀，组织收缩小，但不能沉淀核蛋白，与乙醇混合使用可兼有固定和脱水的作用，细胞核收缩略小，性能略优，但不是最佳。

AFA液由95%乙醇，浓甲醛、冰醋酸混合配制而成，不仅穿透力强，能迅速沉淀蛋白质，还能使细胞染色更清晰。此液中甲醛与乙醇混合兼有固定和脱水的作用，加冰醋酸后促使固定加快，穿透力强[7]，膨胀性强，可以缓冲乙醇的收缩作用，且冰醋酸能增强核染色的选择性，使核浆颜色对比鲜明，加入冰醋酸不仅抵消了乙醇收缩的缺点，使细胞核浆染色更清晰，且冰醋酸还可以有效地防止胶质脱落现象的发生[7]，滤泡胶质几乎全部着色。

综上所述，AFA液固定的甲状腺冷冻切片，固定效果好，镜下最接近石蜡切片HE染色，有助于提高诊断的准确性，所以认为AFA液是以上四种固定液中甲状腺组织快速冰冻切片的最佳固定液之一。