一种适用于微生物学实验教学的改良细菌革兰染色法

王继璇

摘要微生物学实验教学常规细菌革兰染色实验中，常因细菌培养物被反复使用而导致染色结果出现错误。为了提高革兰染色实验教学效果，我们建立了基于10%福尔马林固定菌液的改良革兰染色法。该法染色结果显示，4°C或室温放置5或30 d的福尔马林固定金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌菌液不仅具有100%染色正确率，同时还有菌体染色均匀、轮廓清晰、形態典型等优点，不仅提高了革兰染色实验教学效果，同时也明显减少了实验准备工作量及细菌培养基使用量，较好的改进了革兰染色实验教学中存在的问题。

关键词 微生物实验教学 改良革兰染色法 福尔马林 细菌固定

中图分类号：Q246文献标识码：ADOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2021.20.018

A Modified Bacterial Gram-staining Method Suitable for Microbiologic Experimental Teaching

WANG Jixuan

（Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou， Zhejiang 310006）

AbstractIn the routine bacterial Gram-staining assay of microbiologic experimental teaching， the wrong staining results frequently occur due to the repeated use of bacterial cultures. In order to improve the teaching effect of bacterial Gramstaining assay， we established a modified Gram-staining method using 10% formalin-fixing bacterial suspensions. The stainingresultsoftheformalin-fixedsuspensionsstandingat4°Corroomtemperaturefor5or30dofStaphylococcusaureus， Bacillus subtilis and Escherichia coli using this modified method not only showed 100% correct rate， but also had the advantagessuchasuniformstaining，edgesharpnessandtypicalshapeofbacterialbodies，whichimprovedtheteachingeffect of Gram-stainingassay as well as decrease the work load of experimental preparation and usage of bacterial medium.

KeywordsMicrobiologic experimental teaching； modified Gram-staining method； Formalin； bacterial fixation

革兰染色法是高等院校微生物学实验中最为常用的细菌染色法，不仅可以辅助清晰地观察细菌的形态，同时也能反映不同细菌细胞壁之间的差异并对临床上抗生素的选择具有参考价值。因此，医学、农业、环境微生物学实验教学中均将细菌革兰染色法作为本科实验教学的基本内容之一。然而，现行的革兰染色法染色效果受到较多因素的干扰，包括细菌菌龄、细菌涂片厚度、乙醇脱色时间等的影响，导致最终染色出现假阴性、假阳性的结果，影响实验教学效果。其中在各种影响染色效果的因素中，菌龄对染色结果影响最大，对数生长期的细菌染色结果正确性较高，幼龄或老龄菌染色后易出现假阴性或假阳性染色结果。[1]我国现行的实验教学体系中，通常实验班级较多，故对数生长期细菌往往保存于4°C冰箱贮存备用。但有文献报道，细菌在4°C时仍可缓慢生长，故对数生长期细菌长时间4°C保存并反复使用后，已非处于对数生长期，从而影响革兰染色结果的正确性。[2，3]

我们在长期的医学微生物学实验教学中发现，预先采用福尔马林溶液固定待染色的细菌，可有效地消除菌龄对革兰染色结果的影响，取得了良好的实验效果。接下来笔者就改良后的革兰染色法进行详细的介绍，以期对同类实验教学的开展起到一定的借鉴作用。

1实验步骤与方法

菌种选择及细菌培养：选择金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌分别作为革兰阳性球菌和杆菌、革兰阴性杆菌代表。用火焰灭菌接种环挑取上述菌种接种于琼脂平板或普通肉汤，37°C培养18 h，其中液体培养物定量OD600=1.0。

菌液制备及福尔马林固定：上述用生理盐水洗下的菌苔或细菌培养液2000r/min离心10min，取细菌沉淀悬于适量生理盐水中，2000r/min离心10min，如此重复2-3次。部分离心获得的细菌沉淀中加入适量10%福尔马林溶液，混匀后室温固定15min；将未用福尔马林固定或福尔马林固定的菌液在4°C或室温下放置5或30 d，然后进行革兰染色。

改良革兰染色法：将适量福尔马林固定菌液滴加于洁净载玻片上，用接种环涂布成直径约10mm薄而均匀的菌膜，常规火焰固定；滴加结晶紫染液覆盖菌膜，室温染色1 min，细小水流冲洗数秒后甩干；滴加卢戈氏碘液覆盖菌膜，室温染色1 min，小水流冲洗数秒后甩干；滴加95%酒精覆盖菌膜，轻轻旋转或晃动玻片，室温脱色0.5min，小水流冲洗数秒后甩干；滴加石碳酸复红染色液覆盖菌膜，室温染色1 min，小水流冲洗数秒后甩干，用吸水纸吸尽玻片上水份后用油镜观察。[4]

常规革兰染色法：采用常规革兰染色法染色对数生长期待染色菌种。[4]

细菌染色性判定：每种细菌与培养条件下均选取样本数20，严格控制革兰染色过程一致，染色结束后每张样本拨片随机选取3-5个单层细菌染色区进行显微镜下观察，蓝紫色为革兰阳性、红色为革兰阴性。根据镜下染色结果与标准结果比对结果确定染色结果的正确率。

2結果与分析

2.1不同温度及放置时间对常规革兰染色结果的影响

新鲜培养（37°C培养18 h）后行常规革兰染色的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌染色结果正确率均为100%；4°C冰箱放置5天后的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌培养物革兰染色正确率分别为90%、70%和80%，20°C室温放置5天后金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌革兰染色正确率分别仅为60%和50%，枯草芽孢杆菌染色结果均转为阴性，具体见表1。

在显微镜下观察，革兰染色结果错误的金黄色葡萄球菌部分紫色红色菌体参半，部分完全假阴性呈红色；革兰染色假阴性枯草芽孢杆菌着色变浅、不着色或呈红色且菌体形态发生明显变化，大部分菌体已出现芽孢；革兰染色假阳性大肠埃希菌呈紫色且菌体变小，实验结果见图1。

革兰染色结果的差异主要依据不同细菌细胞壁结构的不同，细菌在对数生长期细胞壁结构最为稳定，呈现典型的革兰染色性。当细菌生长进入静止期或衰亡期以后，随着衰亡期细菌大量出现，菌体自溶现象的发生，细菌的菌体形态与细胞壁结构都发生了变化，从而出现假性染色结果。不同温度（4°C，20°C贮存条件）下，细菌呈现相对缓慢生长，逐步进入静止期或衰亡期，所以不同温度对染色结果的影响也是通过对细菌生长状态的影响进而影响染色结果。

2.2福尔马林固定显著增强染色结果稳定性

采用10%福尔马林固定细菌的改良革兰染色法时，新鲜、室温放置5或30d金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌菌液的染色结果正确率均为100%且呈现典型的菌体形态，实验结果见图2。

10%福尔马林固定处理后，细菌菌体内蛋白变性导致细胞死亡从而保持固有的菌体形态与结构，行革兰染色法镜检后，细胞形态与染色结果均稳定，不受贮存温度与贮存时间的影响，有效的解决了菌龄干扰染色结果的问题。

另一方面，10%福尔马林固定处理后细菌菌液涂片相比于常规使用的斜面固体菌种涂片，更易于涂片均匀，出现单层分散菌体镜像，对于初次接触革兰染色方法的学生实验成功率更高。

3讨论

不同细菌的细胞壁结构存在显著差异，一类细菌细胞壁由细菌胞浆膜和大量肽聚糖组成，另一类为细菌胞浆膜（也称内膜）、少量肽聚糖和外膜组成，这也是前者革兰染色阳性、后者革兰染色阴性的原因所在。[5]目前我国大多数高校微生物学实验教学体系中，存在教学时间集中、学生人数庞大、实验教师编制有限等特点，细菌革兰染色实验中通常无法及时培养和制备新鲜菌液，导致一次培养的细菌需在冰箱放置数天后使用，而不新鲜的菌液直接影响革兰染色的结果，学生染色结果出现异常或错误在我们的日常教学中时有发生。我们的实验结果显示，4°C放置5天后分别有10%、30%和20%的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌菌液革兰染色结果出现错误，室温放置5天后金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌常规革兰染色结果的错误率分别高达40%和50%，枯草芽孢杆菌染色结果甚至全部转为阴性，同时还出现枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌出现不典型的菌体形态，不仅影响了实验教学效果，也易使学生实验成绩评分出现误判。因此，探索并建立稳定可靠的细菌革兰染色法在微生物实验教学中具有较大实际意义。

福尔马林是组织病理学检查技术中常规使用的组织固定剂，可与组织及细胞中蛋白分子的氨基结合并使其固定化，从而有效地保持了组织及细胞的形态和结构。[6]我们将福尔马林组织固定的方法借鉴应用到了细菌学中，研究结果显示，采用10%福尔马林固定细菌而制备的菌液，可在4°C或室温放置30 d内保持染色结果的正确性，同时还有菌体染色均匀、轮廓清晰、形态典型等优点，不仅提高了实验教学效果，同时大大减轻了实验准备的工作量并减少了培养基的使用量。室温放置30 d是我们实验测试的放置时间，更久的室温放置时间可以进一步的进行验证。此外，阿培脱染色法染色白喉棒状杆菌实验也是病原微生物学教学实验中常用染色方法，白喉棒状杆菌的异染颗粒常因细菌多次传代或培养物老化而使异染颗粒不明显甚至消失，[7]从而影响染色结果。探索福尔马林固定的白喉棒状杆菌阿培脱染色能否显示稳定且典型的异染颗粒，值得我们后续进一步的研究。

参考文献

[1]洪庆华，迟杰，齐云，等.影响革兰氏染色结果的原因分析[J].实验技术与管理，2011，28（5）：41-43.

[2]王芳，叶宝兴，宋瑛琳，等.微生物学实验中革兰氏染色两种方法的比较[J].实验室研究与探索，2007，26（8）：123-124.

[3]周智慧，高波，王升智，等.不同保存方法对重组大肠杆菌菌株活性的影响[J].安徽农业科学，2010，38（1）：8-9，15.

[4]李立伟，鲍建芳.感染与免疫学实验教程.第一版[M].杭州：浙江大学出版社，2015：7-8.

[5]严杰.医学微生物学.第一版[M].北京：高等教育出版社，2008：317.

[6]赵宝忠，孙智才，刘增辉，等.对福尔马林固定剂相关理论的再认识[J].临床与实验病理学杂志，2009，25（3）：337-338.

[7]张瑞其，徐仙赟，李小花，等.白喉棒状杆菌异染颗粒重现的实验探讨[J].赣南医学院学报，2010，30（1）：12.