反相纸层析法分离油菜籽中脂肪酸的经验总结

李海霞， 王 晶， 何 莹， 曾汉来， 王学奎， 丰胜求

(华中农业大学 植物科学技术学院 作物学国家级实验教学示范中心， 武汉 430070)

脂肪酸是由碳、氢及氧3种元素组成的一类化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分，为有机体主要能量来源之一。对脂肪酸进行分离与分析的方法有多种[1-4]，目前科研上使用较多的方法主要包括气相色谱法[5-7]、近红外光谱技术法[8-9]、气相色谱-质谱联用法[10-12]等。这些方法的优点是灵敏度高、检出限低、分辨率高和重复性佳，能够对脂肪酸进行准确、快速和全面的检测。但这些方法使用的都是大型精密仪器，价格昂贵，不适宜引入本科实验教学。

在华中农业大学本科生的基础生物化学实验课程中开设了利用反相纸层析法分离油菜籽中主要不饱和脂肪酸的实验内容。利用反相纸层析法分离和测定混合高级脂肪酸的含量是一种较成熟的方法。原理是由于脂肪酸在固定相和移动相中的分配系数不同，其在层析滤纸上移动速率就有差异，所以层析完成后就能使混合脂肪酸各组分分开，然后用醋酸铜处理，将脂肪酸转化成脂肪酸铜盐，再用红氨酸显色，就可以得到蓝灰色的点状层析图谱[13]。虽然反相纸层析法不能定量分析脂肪酸，但该法快速、简便，结果可视性强，有利于学生对脂肪酸基本理论知识的理解，比较适合于人数较多又有一定学时限制的本科实验教学。

按照实验操作步骤[13]，样品经过制备(皂化和酯化)、点样、展开和显色后，理想的结果是在层析纸上出现比较清晰的3～5个相互分离的蓝灰色斑点(图1)。然而在实验教学中由于受到多种因素的影响，经常会出现各种各样的问题，尤其是脂肪酸层析图谱分不开的问题——拖尾现象(图1-D)，即各斑点之间界线不明，或者根本没有界线，导致老师及学生具有一定的失败感。经过多年大量的实验摸索，不断优化实验条件，使反相纸层析法在实验教学中取得了较满意的结果。现将经验进行如下总结。

A：高芥酸油菜；B：低芥酸油菜；C：层析图谱倾斜；D：拖尾现象。1：亚麻酸；2：亚油酸；3：油酸；4：二十碳烯酸；5：芥酸

图1油菜籽中主要不饱和脂肪酸反相纸层析图谱

Figure 1 Reversed-phase paper chromatogram of main unsaturated fatty acids from rapeseed

1 层析纸制作

先将新华1号层析滤纸裁成15 cm×15 cm大小，然后将一定浓度的液体石蜡-石油醚溶液倒入瓷盘内，再将裁好的滤纸在溶液中拖过，浸透后立即取出，晾干即可。虽然处理好的滤纸可以存放，但不宜超过两个星期。

在层析纸制作时应注意，每次只能处理1～2张滤纸，且滤纸在液体石蜡-石油醚溶液中的操作要快，一定不能浸泡，由于石油醚具有挥发性，这样操作会使滤纸上的液体石蜡的浓度不均一，而导致同一批次处理的层析纸层析效果不稳定而变差。

通过6%、8%、10% 等不同体积浓度的液体石蜡-石油醚溶液(如配制100 mL 6%液体石蜡-石油醚溶液配方是：6 mL液体石蜡+ 94 mL石油醚)处理滤纸的对比实验，发现6%浓度处理的滤纸虽然层析速度较快，但层析效果不是很好，10%浓度虽然层析效果不错，但层析速度较慢，综合起来8%浓度层析效果最佳，层析时长为1.5～2 h，适合实验教学学时安排。因而在实验准备中选择用8%浓度的液体石蜡-石油醚溶液处理滤纸。

文献[14]报道用沸点60℃～90℃的石油醚代替30℃～60℃ 的石油醚处理层析纸更经济。我们通过实验发现，用60℃～90℃ 的石油醚配制的500 mL 8%液体石蜡-石油醚溶液可以制作80～90张层析纸，而用30℃～60℃ 的石油醚配制的仅可以制作50～60张。此外，用60℃～90℃的石油醚处理的层析纸层析效果较稳定，因为它的挥发速度比30℃～60℃ 的石油醚慢，使层析纸上的石蜡分布比较均匀。因此，在处理层析纸时采用沸点60℃～90℃代替30℃～60℃的石油醚。

2 样品制备

2.1 样品皂化和酯化

干燥的油菜籽磨碎后，以8∶1(V/W)的比例加入5%KOH溶液，放置2～3 d，使样品充分皂化和酯化，用以提取脂肪并使其转化为脂肪酸甲酯。使样品皂化和酯化的试剂配方一般用5% KOH 甲醇溶液。因为95%乙醇比甲醇毒性小，经过实验，用5 g KOH+100 mL 95% 乙醇效果也不错，因此我们选择了用95%乙醇配制的5% KOH溶液。另外，酯化好的样品溶液经实验证明室温下可长期保存。

2.2 点样液制备

在酯化好的样品溶液中，先以2∶1(V/V)的比例加入1 mol/L盐酸，使脂肪酸甲酯转化为各种游离的脂肪酸，再以1∶1(V/V)的比例加入石油醚用于萃取脂肪酸，混匀，静置，上层即为点样液。若加入的盐酸量不足，不能使脂肪酸甲酯充分转化为脂肪酸[14]，就会导致脂肪酸层析图谱不能完全分开，可通过加入梯度量的盐酸找到最适合的盐酸用量。

点样液的浓度可通过加入不同量的石油醚来调整。若后续要定量点样，萃取时应加入60℃～90℃的石油醚，因为30℃～60℃的石油醚挥发较快，用移液器吸取微量点样液后还来不及点样就会挥发完。

3 点样

在处理好的层析纸一端用铅笔轻轻画一直线，每间隔一定距离用铅笔点一记号，在记号处用针刺一小孔(一定要与纸垂直穿透)，然后用移液器吸取点样液 5 μL(通过实验确定的最佳点样体积)，分2～3次点入孔洞处，斑点应小而圆，直径不能超过0.3 cm。

点样技术也直接影响脂肪酸层析图谱质量的优劣，以下3点一定要注意：1)用移液器吸取点样液后应尽快点样，不要耽搁时间太长，否则会出现没有层析斑点或斑点太淡的现象；2)点样液分2～3次点入孔洞时，斑点应小而圆，而且要等前一次的点样液干燥后再点入下一次，否则易出现拖尾现象；3)点样时，枪头每次都要对准孔洞，且枪头与层析纸一定要垂直，否则也易出现拖尾现象。

4 展开溶剂系统与条件

将点好样的层析纸点样面朝内卷成筒状，用订书机固定两端，使编号端朝下放入盛有95%醋酸溶液(展层剂)的层析缸中，并立即盖好层析缸盖子开始层析(注意检查密闭性)。当展层剂前沿上升到距滤纸顶端1～2 cm处时停止层析，取出层析纸，用吹风机吹干层析纸。

将点好样的层析纸卷成筒状并用订书机固定时两侧不能重叠，需留有一点缝隙，否则层析图谱会出现倾斜情况。95%醋酸溶液的多少以能够浸泡层析纸但液面低于点样处为宜，过少会使层析时间延长，过多会使液面高于点样处而使脂肪酸样品溶解在展层剂中而不能层析。此外，因为醋酸易挥发，用95%醋酸溶液做展层剂连续使用几次后浓度降低，使层析速度变慢，且图谱也易出现拖尾现象。因而针对同一个层析缸，在层析2～3次后一定要更换新的95%醋酸溶液才不会影响层析效果。

5 显色

通过实验，我们将文献[13]中的1%醋酸铜溶液改成0.1%的浓度，显色后非但没有影响层析斑点的颜色，层析纸背景的颜色还变淡了，层析效果变优，同时又节约了试剂用量。

显色过程为将吹干的层析纸放入0.1%醋酸铜溶液中浸泡15～20 s，使脂肪酸生成脂肪酸铜盐。先用清水冲洗，再放入洁净的瓷盘中，用流水漂洗30 min以上。然后将层析纸小心取出，放置在洁净的吸水纸上，用电吹风吹干。再将吹干的层析纸在0.03%红氨酸溶液中一带而过，即可在层析纸上显出蓝灰色的斑点。高芥酸油菜有5个斑点(图1-A)，从上往下分别是亚麻酸、亚油酸、油酸、二十碳烯酸和芥酸，低芥酸油菜有3 ～ 5 个斑点，3个斑点时没有芥酸和二十碳烯酸(图1-B)，4个斑点时没有芥酸。

实验时脂肪酸层析图谱容易出现的问题除了拖尾现象，还有背景颜色过深、层析图谱倾斜(图1-C)等，对此进行了常见问题解析(表1)，在实验教学中能针对性解决脂肪酸层析中出现的问题。

表1 反相纸层析法分离油菜籽中主要不饱和脂肪酸常见问题解析

随着信息技术的发展，开展示范性虚拟仿真实验教学项目建设，是提升实验教学质量和水平的重要举措[15]。后续我们将进行采用气相色谱-质谱联用仪对多种脂肪酸进行测定的虚拟仿真实验教学项目的建设，以此实现在“主要不饱和脂肪酸的分离”实验教学中采取虚实结合的方法进一步提高基础生物化学实验教学的质量。