超临界二氧化碳萃取大别山五针松针叶挥发油及其成分分析

项小燕， 吴甘霖， 段仁燕， 王志高， 刘家雷

(1. 安庆师范大学 生命科学学院， 安庆 246133； 2. 皖西南生物多样性研究与生态保护安徽省重点实验室， 安庆 246133; 3. 岳西县林业总场， 岳西 246600)

大别山五针松(PinusdabeshanensisW. C. Cheng & Y.W. Law), 隶属松科松属，仅分布于我国东部大别山区900～1300 m的狭小范围内，野生种群仅200余株[1]。近年来，种群的保护已引起了国家相关部门及一些科研人员的关注。目前已有研究分别从花粉飞散[2]、花粉活力[3]、种间联结和竞争[4-5]及遗传多样性[6]等方面对大别山五针松的濒危机制进行了报道。除自身生物学特性外，该物种还受到一些昆虫的取食和危害，从而加剧了其濒危的速度。

在正常的生理状态下，植物会产生相应的挥发物，在昆虫寻找寄主的识别过程中起着关键的通讯引导作用，从而调控着昆虫的寄主定向、产卵、逃避、取食等多种行为[7～8]。大别山五针松虫害的发生应该有其特殊的原因，其挥发性物质的特异组分可能是昆虫对寄主定向选择的重要信息物。然而，大别山五针松挥发油的化学成分研究尚未见报道。针叶是大别山五针松植株的重要组成部分，因而本研究用超临界二氧化碳萃取法提取大别山五针松健康株针叶的挥发油，并进行GC-MS分析，以期为揭示昆虫与大别山五针松的寄主机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料的采集

2016年4月，从安徽省岳西县大王沟大别山五针松自然种群采集健康株针叶。经安徽师范大学生命科学学院张小平教授鉴定为大别山五针松(P.dabeshanensisW. C. Cheng & Y.W. Law)的针叶，凭证标本保存于安庆师范大学标本馆。

1.2 超临界二氧化碳萃取

所采集的针叶60℃烘干至恒重。将烘干的针叶粉碎过10目筛。称取250 g粉末置萃取釜中按以下条件萃取。萃取釜压力24 Mpa(温度45℃)，分离釜I压力9 Mpa (温度40℃)，分离釜Ⅱ压力5 Mpa(温度35℃)，CO2流量12 L/h，萃取2 h。得精油0.59 g，得率为0.24%，所得精油置4℃避光保存待用。

1.3 GC-MS分析条件

所得精油在HP6890/5973 GC-MS联用仪(美国，惠普公司)上进行分析，进样量1 μL。色谱柱为石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，初始温度60℃(保留5 min)，程序升温，以10℃/min升温至 250℃，保持18 min。载气为高纯He(99.99%)，流速1 mL/min。进样口温度为250℃(分流比50∶1)，检测温度保持在280℃。质谱条件：离子源为EI源(70 eV)，离子源温度230℃，质量扫描范围为30～550 amu。将总离子流图中各峰经质谱扫描后得到质谱图，通过HPMSD化学工作站，结合Wiley 275和NIST 98标准质谱图库进行检索，采用峰面积归一化法计算各组分在挥发油中的相对百分含量。

2 结果与分析

按GC-MS分析条件，取供试品溶液1.0 μL进样，得超临界二氧化碳萃取的大别山五针松针叶挥发油的总离子流图，见图1。经GC-MS分析后，共鉴定出33种化合物，用峰面积归一化法算出其百分含量，所鉴定的化合物占总离子流图峰面积的81.70%。所鉴定的物质主要由萜类(36.65%)、醇类(22.96%)、烷烃类(11.33%)和酯类(10.76%)等化合物组成。其中，(-)-斯巴醇(11.55%)，d-杜松烯(10.72%)、α-杜松醇(8.65%)、石竹烯(7.26%)和蒎烷(6.43%)等化学成分的相对含量较高，结果见表1。

图1 SFE法提取的大别山五针松针叶挥发油的总离子流图

化合物Compounds分子式Molecular formula分子量/kuMolecular weight相对含量/%Relative amount烷烃类 Alkanes蒎烷2,6,6-Trimethylbicyclo [3.1.1]heptaneC10H181386.43Naphthalene, 1,2,4a,5,6,8a-Hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-C15H242042.421-异丙基-7-甲基-4-亚甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢化萘1-Isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthaleneC15H242041.28(1R,4aR,8aS)-,1,2,4a,5,6,8a-六氢化-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-, (1R,4aR,8aS)-C15H242040.88十二甲基-环六硅氧烷Cyclohexasiloxane, dodecamethyl-C12H36O6Si64440.32萜烯类 Terpenesd-杜松烯d-CadineneC15H2420410.72石竹烯CaryophylleneC15H242047.262,8-二甲基-1,8-壬二烯1,8-Nonadiene, 2,8-dimethyl- C11H201523.84(+)-表倍半水芹烯 (+)-Epi-bicyclosesquiphellandreneC15H242043.22西松烯1,3,6,10-Cyclotetradecatetraene,3,7,11-trimethyl-14-(1-methylethyl)-C20H322722.45α-衣兰油烯α-MuuroleneC15H242040.88α-石竹烯α-CaryophylleneC15H242041.67可巴烯Copaene C15H242041.58香树烯AlloaromadendreneC15H242040.95大根香叶烯D Germacrene DC15H242040.94环氧白菖油烯Calarene epoxideC15H24O2200.72环氧异香橙烯Isoaromadendrene epoxideC15H24O2200.69

续表1(Continued Table 1)

化合物Compounds分子式Molecular formula分子量/kuMolecular weight相对含量/%Relative amount(6E,10E)-7,11,15-三甲基-3-亚甲基-1,6,10,14-十六碳四烯(6E,10E)-7,11,15-Trim-ethyl-3-methylene-1,6,10,14-hexadecatetraeneC20H322720.63去氢白菖烯CalameneneC15H222020.34α-荜澄茄烯α-CubebeneC15H242040.22B-榄香烯B-ElemenC15H242040.32B-新丁香三环烯B-Neoclovene C15H242040.22醇类 Alcohols(-)-斯巴醇 (-)-SpathulenolC15H24O22011.55α-杜松醇α-CadinolC15H26O2228.653,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇3,7,11,15-Tetramethyl-2- hexadecen-1-olC20H40O2962.76酯类 Esters丁基香茅酯Citronellyl butyrateC14H26O22263.474-羟基-4-甲基-2-戊酮2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl-C6H12O21162.29油酸乙酯Ethyl oleate C20H38O23101.58棕榈酸乙酯Hexadecanoic acid, ethyl ester C18H36O22841.20亚油酸乙酯Ethyl linoleate C20H36O23081.03菊酸乙酯Ethyl chrysanthemateC12H20O21960.48邻苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalateC16H22O42780.38醋酸冰片酯Bornyl acetateC12H20O21960.33

3 讨论

萜类化合物是植物的特异气味组分, 在许多害虫对寄主的选择和识别过程中起着关键的作用[9]，可作为信号介导对植食性昆虫产生防御反应, 并在植物-害虫-天敌的三级营养关系中发挥作用[8]。朴相勇等[9]和滕坤等[10]用水蒸气蒸馏法分别从红松和赤松中提取到了α-蒎烯、β-水芹烯和莰烯等成分。田玉红等[11]用水蒸气蒸馏法从拉雅松和细叶云南松松针中提取到了较高含量的α-蒎烯和β-石竹烯。研究表明, 影响和调节松科害虫取食和产卵行为最为重要的信号物质包括萜类化合物中的蒎烯、莰烯和水芹烯等[9]。本文首次报道了大别山五针松针叶挥发油的主要成分。尽管所提取的挥发油中也检测到较高含量的萜类化合物，但未发现上述几类重要的信号物质。因而，大别山五针松挥发物对害虫具体产生了怎样的影响还需要从昆虫的电生理及嗅觉反应等方面进一步测定。

大别山五针松针叶挥发油的成分和含量与上述物种有所不同，可能是不同的植物挥发油存在较大差异[12-13]，也可能是提取方法不同而导致。以往研究多以水蒸气蒸馏法提取针叶挥发油，而本文采用了超低温、萃取效率高的超临界二氧化碳萃取法提取大别山五针松针叶的挥发油。

尽管目前在大别山五针松针叶的挥发油中未发现重要的植物-害虫-天敌信号化合物，本研究也检测到了一些有价值的成分。如d-杜松烯和蒎烷可用于制作香料，石竹烯和斯巴醇具平喘、祛痰功效。因而本研究为后期人工栽培进一步开发利用针叶资源提供了科学依据。

致谢：感谢安庆师范大学生命科学学院吴彦教授在超临界流体萃取方法中给予的技术指导。