药品检验常用标准菌种的斜面保藏方法研究

戴宇婷 刘自昭

标准菌种（如CMCC或ATCC）是经过准确鉴定的分离的菌株，由国内或国际菌种机构保藏的遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌种[1]。标准菌种是微生物检测中必不可少的标准物质，对评价检测方法、校准仪器设备、检测能力验证、培养基和检测试剂的质量控制、检测过程和结果的评价都有着重要作用[2]。据2015版《中国药典》，标准菌种在检验过程中、阳性对照试验、培养基适用性检查、方法适用性试验等方面都有使用，并有详细要求。因此标准菌种在药品检验中有着重要作用。标准菌种的保藏是微生物学检验工作中的一项重要工作，需保证其生物学特性，减少污染和生长特性的改变。2015版《中国药典》要求菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存[3]。不良的方法会导致菌种发生老化、退化、变异、污染等情况[4]。常用的保藏方法有很多，如斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、冷冻真空干燥保藏法等。根据不同的菌种保藏方法也不同，以保证其生物学特性不变，同时还要考虑使用的范围、设备的情况、操作的简便性、方法的通用性等。其中斜面低温保藏法作为短期保藏的方法最常用，其操作简便，存活率高，适用菌系范围比较广，简单易行，便于操作和观察，成本比较低[5]。但保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏[6]，易被污染变异。因此，有必要对此方法保藏不同菌种的条件、期限、方法等进行验证试验。为菌种管理的程序化标准化提供依据，保证操作的统一性，为试验结果的一致性提供保障。

1 试验材料

1.1 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基TSA（批号：1612232）、沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA（批号：160913）均为北京三药科技开发公司产品，并经过适用性检查。

1.2 菌种

中国食品药品检定研究院：白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44 102 ]、乙型副伤寒沙门氏菌[CMCC（B）50 094]、短小芽孢杆菌[CMCC（B）63 202]、藤黄微球菌[CMCC（B）28 001]。

1.3 仪器设备

压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-75G（上海博迅实业有限公司），生化培养箱LRH-250F（上海一恒科技有限公司），生物安全柜BHC-1300ⅡA2（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），鼓风电热干燥箱GZX-9246MBE、电子天平ML503 /02[梅特勒-托利多（上海）公司]，全自动微生物分析系统仪VITEK2 Compact（法国梅里埃）。

2 方法

将菌种接种在斜面培养基上，其中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门氏菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌接种在胰酪大豆胨琼脂培养基斜面上，白色念珠菌和黑曲霉接种在沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上。各菌种的胰酪大豆胨琼脂培养基斜面除藤黄微球菌26～27℃培养48 h外其余均30～35℃培养18～24 h，白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面20～25℃培养2～3 d，黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面20～25℃培养5～7 d。待菌种充分生长后将培养好的新鲜菌种贴上标签，用牛皮纸包好，置于4～6℃的冰箱保存。定期检查菌种情况并记录，考察期限6个月。

标准菌种经确认试验，每种菌种每代接种5支斜面，每隔一定时间（保藏期内）再转接至新的斜面上培养，生长后继续保藏，如此连续不断至第5代。

3 实验结果

白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌保存时间均超过6个月。金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌保存时间在3～6个月。乙型副伤寒沙门氏菌和藤黄微球菌保存时间在2～3个月。铜绿假单胞菌保存时间在1～3个月，铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡[4]，因此室温保存，保存时间与室温温度有关差异较大，室温低于10℃以下，保存时间要短些，最长存活2个月，温度在10℃以上可保存2～3个月。5代特性基本不变，保存期限基本一致。但斜面培养基在3个月后有不同程度的干燥情况。见表1。

4 讨论

4.1 保藏方法的选择

菌种的保藏在药品微生物检验工作中起着至关重要的作用，由于菌种的特性不同及菌种保藏方法的优缺点各异[7]，每种方法都有各自的适用范围和优缺点，应根据菌种的生物学特性、自身的设备条件及实验室工作内容选择不同的保藏方法，才能保证菌种的纯度和活性，达到研究和药品检验的需求。本文仅对斜面保藏法进行讨论，一些不适合用本法保藏的菌种和其他的保藏方法需另行试验。

表1 药品检验常用菌株斜面保藏法的试验结果

4.2 本试验的参考意义

本保藏方法操作简便，便于提取，但需要经常移种培养，且培养过程中微生物和菌种难免与外部环境接触因此无法排除变异的可能[8]。《中国药典》2015年版要求菌株的传代次数不得超过5代，若每月传种l次，新购的菌种用不了几次，有的可能还未用就淘汰了。通过本实验可总结适宜保存期限，以减少传代次数，降低污染风险，节约成本。

4.3 保障标准菌种质量的重要意义

微生物具有生命活力，每一代生存时间一般很短，易在传代过程中发生变异甚至死亡[9]。微生物与药物的生产与检验关系较大[10]，科学的标准菌种保藏方法和管理制度是实验质量的重要保障，对提升实验室检验工作具有重要意义。菌种保藏时，应注意控制好光照、温度及湿度，否则会引起菌种退化[11]。在实践过程中通常会同时选择多种保藏方法，长期保藏方式和短期保藏方式相结合[12]，以确保标准菌种质量。

除本文讨论的斜面保藏法外，还有许多不同的保藏方法，每种保藏方法都有各自优缺点，也有各自的适用范围。在药品检验工作中需制定科学的标准菌种管理制度，并严格执行管理制度。理清所需标准菌种，根据实际情况选择合适保藏方法，以保证菌种质量及使用安全，确保检验质量。