酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶的异源表达及催化生成糠硫醇

扎木苏，杨华青，王 鑫，孙宝国，王成涛,*，卢 松

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京 100048；2.阜丰集团内蒙古阜丰生物科技有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030）

挥发性硫醇类化合物是多种食品（肉制品、水果、蔬菜、茶、咖啡及酒精饮料等）的重要风味成分[1-4]，由于其极低香气阈值和独特香气特征[5-6]，使其在食品风味形成中扮演着重要角色，成为一类应用广泛的食用香料[7-8]。糠硫醇、3-甲硫基丙醇等硫醇类化合物在中国白酒风味中发挥着特殊作用[9-11]，具有强烈的葱香、肉香、烤香和芝麻香等香气特征，被认为是中国芝麻香型白酒的重要香气成分[12-13]。

近年研究发现，微生物来源的β-裂解酶参与硫醇类物质的合成，大部分的细菌具有β-裂解酶活力，可以催化裂解醛-半胱氨酸加合物合成硫醇[14-15]。Tominaga等[16]首次发现细菌和植物来源的C—S β-裂解酶可以催化裂解半胱氨酸加合物生成3-巯基-1-己醇（3-mercapto-1-hexanol，3MH）和4-甲基-4-巯基-2-戊酮（4-mercapto-4-methylpentan-2-one，4MMP）。Swiegers等[17]研究发现大肠杆菌中tnaA基因所编码的色氨酸激酶具有强C—S β-裂解酶活力，该基因超表达的工程菌可有效提升其葡萄酒中硫醇类物质含量。虽然多种细菌具有C—S β-裂解酶活力，但这些细菌通常不是食品级微生物，只有少数食品级微生物具有C—S β-裂解酶活力，如S. cerevisiae含有胱硫醚β-裂解酶（cystathionine β-lyase，Str3p），可裂解胱硫醚中的C—S键。Huynh等[18]研究面包酵母在生物转化制备硫醇中的应用。Thibon等[19]报道葡萄酒中酵母菌可催化半胱氨酸加合物生成硫醇类物质。研究发现，有些酵母来源的基因参与硫醇类物质合成，但这些基因及其编码酶在硫醇类物质合成中的作用仍不明晰。本课题组前期研究中，从芝麻香型白酒大曲中筛选获得1 株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）G20，发现菌株可利用半胱氨酸糠醛加合物合成糠硫醇，通过基因超表达和敲除发现Str3基因是糠硫醇合成关键基因[11,20]，但其功能还未明晰。

本实验将来源于S. cerevisiae G20的Str3基因重组转化到E. coli BL21中进行超表达，正交设计试验优化重组蛋白Str3p诱导表达条件以提高其表达量，亲和层析纯化后研究Str3p催化生成糠硫醇的能力，该方面研究将为糠硫醇生物转化、发酵食品特征风味形成提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种和质粒

酿酒酵母（S. cerevisiae）G20由本实验室保存；pEASY-E1、大肠杆菌（Escherichia coli）Trans-T1感受态北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌BL21（DE3）北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 培养基与试剂

LB液体培养基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0；LB固体培养基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，琼脂15.0 g/L，pH 7.0。

糠硫醇、L-胱硫醚 美国Sigma公司；半胱氨酸、糠醛、磷酸吡哆醛、咪唑、异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 北京半夏生物科技有限公司；PrimeSTAR Max Premix（2×）宝生物工程（大连）有限公司；酵母基因组提取试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒 北京天根生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PowerPac Basic电泳仪、C1000-Touch聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；小型高速离心机 美国Sigma公司；SPX-150B生化培养箱 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；BioSpectrum凝胶成像仪 美国UVP公司；气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 酿酒酵母Str3基因的克隆及重组菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3）的构建

以糠硫醇合成菌株S. c e r e v i s i a e G 2 0的全基因组为模板，设计引物S t r 3-f（ATGCCGATCAAGAGATTAGATACAG）和Str3-r（CTTACAATTTCGAACTCTT）克隆Str3基因，PCR条件：95 ℃变性5 min；95 ℃、30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃、8 s，循环30 次；72 ℃延伸10 min。参考pEASY-E1使用说明，将纯化回收的目的片段与质粒pEASY-E1连接，电击转化至大肠杆菌Trans-T1感受态，菌液涂布于200 μg/mL氨苄青霉素LB抗性平板上。37 ℃培养12 h后挑取单菌落、培养，提取质粒经PCR（T7 Prmoter Primer和Str3-r验证阳性克隆）和测序验证，获取表达载体pEASY-E1-Str3。表达载体经热激转化至宿主菌E. coliBL21（DE3），于200 μg/mL氨苄青霉素LB抗性平板上筛选获得阳性重组子E. coliBL21（pEASY-E1-Str3）。

1.3.2 重组E. coliBL21（pEASY-E1-Str3）的Str3p表达

将培养过夜的重组大肠杆菌E. coliBL21（pEASYE1-Str3）按体积分数1%接种到200 mL LB液体培养基（含200 μg/mL氨苄青霉素）中，37 ℃、200 r/min培养至OD600nm值为0.4～0.6，加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG于16 ℃、150 r/min诱导9 h，菌液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，菌体经悬浮、洗涤（0.1 mol/L磷酸缓冲液，pH 7.4）后备用。

1.3.3 Str3p的纯化

1.3.3.1 粗酶液提取[20]

将1.3.2节离心收获的菌体重悬于破壁缓冲溶液（含50 mmol/L Tris，pH 8.0，100 mmol/L KCl，10%甘油，0.25 mmol/L Triton X-100，10 mmol/L咪唑，100 μmol/L磷酸吡哆醛）中，冰水浴超声（225 W，超声6 s，间隔3 s）处理10 min，细胞破碎液在4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集的上清液即为粗酶液。

1.3.3.2 HisSep Ni-NTA纯化Str3p[20]

层析柱经平衡缓冲溶液（20 mmol/L Tris，pH 7.0，250 mmol/L KCl，100 μmol/L磷酸吡哆醛和20 mmol/L咪唑）预平衡，设置流速1 mL/min，将上清液加入层析柱，并用30 mL平衡缓冲液（1 mL/min）进行冲洗，随后用洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris，pH 7.0，250 mmol/L KCl，100 μmol/L磷酸吡哆醛，200 mmol/L咪唑）进行洗脱，收集洗脱液并于4 ℃保藏备用。

1.3.4 酶活力测定

参考曹珊珊等[21]的方法，并进行一定修改。设置反应体系为100 μL，在5 mmol/L的L-胱硫醚底物溶液（0.1 mol/L K2HPO4溶液配制，pH 7.4）中加入适量酶液（20 μg/mL），37 ℃水浴保温20 min，然后煮沸2 min终止反应，在反应液中加入100 μL 1 mmol/L的2,4-二硝基苯肼和1 mL 0.4 mol/L的NaOH溶液，室温静置30 min。于520 nm波长测定吸光度，以不加酶液的反应液为对照。以不同浓度的丙酮酸钠标准溶液和2,4-二硝基苯肼反应，绘制丙酮酸钠浓度和吸光度之间的标准曲线。

酶活力定义[21]：1 个酶活力单位（1 U）为37 ℃、pH 7.4、1 h能催化产生1 μmol/L丙酮酸的酶量。

1.3.5 蛋白含量测定

采用Bradford法[20-21]测定蛋白质含量并绘制牛血清白蛋白标准曲线。

1.3.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

细胞破碎上清液和洗脱液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析目的蛋白纯化结果，使用考马斯亮蓝R-250染色。

1.3.7 诱导条件对Str3p表达量的影响

将培养过夜的重组菌E. coliBL21（pEASY-E1-Str3）按体积分数1%接种到200 mL含有200 μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD600nm值为0.4～0.6，诱导条件选取IPTG诱导浓度、诱导时间和温度作为影响蛋白表达量的主要因素，研究以上诱导条件对Str3p表达量的影响，同时采用正交设计试验法优化Str3p的表达量。

1.3.7.1 单因素试验

在1.3.7节的培养液中添加IPTG终浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L，于16 ℃、150 r/min诱导9 h，收集粗酶液测定酶活力；在培养液中加入终浓度0.5 mmol/L IPTG，控制温度16、20、25、30、37 ℃，150 r/min诱导9 h，收集粗酶液测定酶活力；在培养液中加入终浓度0.5 mmol/L IPTG，于20 ℃、150 r/min分别诱导5、7、9、11、13、15 h，收集粗酶液测定酶活力。

1.3.7.2 正交设计试验优化Str3p酶活力

根据单因素试验结果，选取影响Str3p表达量各因素中有意义的水平，以IPTG浓度、诱导温度和时间为3 个考察因素（表1），选取3 个水平并采用L9（33）正交表进行正交试验设计，确定最适诱导条件并验证。

表1 IPTG诱导条件优化L9（33）正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in L9 (33) orthogonal array design for optimization of IPTG induction conditions

1.3.8 Str3p催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物

半胱氨酸-糠醛加合物制备参考Huynh等[18]的方法。催化反应体系500 μL为：50 μg/mL Str3p、50 mmol/L磷酸缓冲液、pH 5.0～8.0、20 μmol/L磷酸吡哆醛、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L半胱氨酸-糠醛加合物，30 ℃水浴保温1 h，以添加灭活蛋白的反应液为空白，检测糠硫醇产量。

糠硫醇的检测参考扎木苏等[20]的方法并稍作修改，取500 μL反应液，分别用0.5 mL二氯甲烷萃取2 次，合并萃取液后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取有机层（下层）液体，经0.22 μm有机滤膜过滤装入小瓶密封冷藏，待分析。

气相色谱-质谱条件：T G-5 M S毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃，载气He（99.999 5%），流速1.5 mL/min；不分流进样，进样量1.0 μL；升温程序：初始温度35 ℃持续2 min，以10 ℃/min升至280 ℃，恒温15 min；质谱条件：电子电离源，质谱传输线温度230 ℃，离子源温度230 ℃，溶剂延迟3 min，选择离子对监测，糠醛（m/z96→95）、糠硫醇（m/z81→53）。

1.4 数据处理

实验中每个处理平行重复3 次，采用SPSS 17.0软件进行数据的处理和分析，采用Origin 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母Str3基因克隆及重组质粒pEASY-E1-Str3的构建结果

图1 PCR克隆重组质粒pEASY-E1-Str3凝胶电泳图Fig. 1 Electrophoresis of PCR-amplified pEASY-E1-Str3

由图1可知，PCR产物条带约1 400 bp，与预期大小相符。重组质粒经PCR验证和测序分析，确认其大小及测序结果与GenBank中已报道的酿酒酵母Str3基因一致。由图2可知，重组质粒双酶切验证，分别呈现5 700 bp和1 400 bp两条条带，分别与质粒pEASY-E1和Str3基因大小一致；重组质粒条带约7 100 bp，与预期大小相符，说明重组质粒pEASY-E1-Str3构建成功。

图2 重组质粒pEASY-E1-Str3及其酶切凝胶电泳图Fig. 2 Electrophoresis of pEASY-E1-Str3 and restriction enzyme digestion product

2.2 Str3p异源表达工程菌构建

Str3p经E. coliBL21表达，并在其辅因子（磷酸吡哆醛）存在的情况下，利用镍柱纯化，最终获取目的蛋白。如图3所示，目的蛋白分子质量约为52 kDa，这与酿酒酵母Str3p分子质量的理论计算值（52.7 kDa）一致。重组菌在低温条件下诱导，Str3p表达量较高，其质量浓度约为0.89 mg/mL。Holt等[20]同样表达纯化酿酒酵母VIN 13的Str3p，其分子质量约为52 kDa，与本实验结果一致。

图3 SDS-PAGE分析Str3p纯化结果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of nickel affinity-purified Str3p

2.3 诱导条件对工程菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3）的Str3p表达量的影响

2.3.1 IPTG浓度对Str3p表达量的影响

图4 IPTG浓度对Str3p酶活力的影响Fig. 4 Effect of IPTG concentration on the activity of Str3p

如图4所示，IPTG浓度对Str3p酶活力变化有显著影响（P＜0.05），随其浓度的增加，Str3p酶活力呈现先增后降的趋势，其中最适IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L，当IPTG浓度过高时，可能会影响菌株生长和蛋白的表达，进而导致Str3p酶活力降低。

2.3.2 诱导温度对Str3p表达量的影响

由图5可知，诱导温度对Str3p表达量的影响极显著（P＜0.01），Str3p最适诱导温度为20 ℃，随着温度的升高，酶活力逐渐下降。通常温度的升高往往会使蛋白错误折叠形成包涵体，从而失去活力，但过低的温度也会导致菌体生长受到抑制，使蛋白表达量下降。因此，适宜的温度条件下诱导，有利于Str3p的表达。

图5 诱导温度对Str3p酶活力的影响Fig. 5 Effect of induction temperature on the activity of Str3p

2.3.3 诱导时间对Str3p表达量的影响

图6 诱导时间对Str3p酶活力的影响Fig. 6 Effect of induction time on the activity of Str3p

如图6所示，诱导时间对Str3p表达量有显著影响（P＜0.05），随诱导时间的延长，Str3p酶活力不断上升，当诱导时间大于13 h时，Str3p酶活力急剧下降，因此认为13 h为适宜的IPTG诱导时间。通常诱导时间短，菌体生长仍处于适应期，蛋白表达量较低，以致酶活力降低。随诱导时间的延长，蛋白表达量增加，但同时可能导致目的蛋白降解及菌体老化，使其得率下降，导致酶活力降低。

2.4 正交设计试验优化Str3p酶活力结果

表2 最适诱导条件优化正交试验设计与结果Table 2 Design matrix and experimental data for optimization of ITPG-induced expression of Str3p

根据单因素试验结果，选择对E. coliBL21（pEASYE1-Str3）蛋白表达量影响较大的3 个因素，IPTG浓度（A）、诱导温度（B）和诱导时间（C），采用L9（33）正交表进行正交设计试验，其结果见表2。

由表2可知，3 个因素条件对Str3p表达量的影响大小依次为IPTG浓度＞诱导温度＞诱导时间，最优诱导条件为A2B2C3，即IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导温度20 ℃、诱导时间13 h。按照优化诱导条件进行3 次平行验证实验，Str3p最高表达量为1.26 mg/mL，与未优化时的表达量（0.89 mg/mL）相比，正交试验优化使得Str3p表达量提高41.7%，且在该条件下酶活力较优化前提高38.6%，明显提高Str3p的表达量及其酶活力，满足后续催化实验需求。

2.5 反应液挥发性成分分析

图7 糠醛（A，5.29 min）和糠硫醇（B，6.52 min）气相色谱-质谱全扫描质谱图[11]Fig. 7 Full-scan MS spectra recorded at 5.29 min for furfural (A) and at 6.52 min for 2-furfurylthiol (B)

如图7所示，GC-MS分析发现一个保留时间为5.29 min的目标化合物，其离子流图显示特征离子为m/z95和96，另一个化合物在保留时间为6.52 min处显示的特征离子为m/z53、81和114，这与NIST谱库中糠醛和糠硫醇的特征离子m/z相匹配。

图8 糠醛和糠硫醇选择离子扫描EIC图Fig. 8 Comparison of GC-MS/MS chromatograms recorded for furfural and 2-furfurylthiol

通过考察标准品的出峰情况，同样在相同的保留时间检出上述特征离子，说明反应液中存在这2 种物质。从图8A可以看出，7.4 mmol/L糠醛和49.5 μmol/L糠硫醇的特征离子对分别在5.29 min和6.52 min出峰，图8B是Str3p催化反应液的出峰情况，其定性离子对与标准品出峰保留时间一致，一方面说明定性结果准确可靠，另一方面证实催化反应生成糠硫醇。

2.6 Str3p催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物

前期研究工作确认酿酒酵母中Str3基因是糠硫醇合成中的关键基因[12]，但还需进一步验证其功能。通过异源表达所得的重组蛋白Str3p，其催化生成糠硫醇情况如图9所示，Str3p酶活力受pH值影响较大（P＜0.05），随着pH值的升高，催化效率逐渐增加，当pH 8.0时，催化效率达到最大，在底物浓度10 mmol/L、50 μg/mL的Str3p 1 h能催化产生47 μmol/L的糠硫醇。有学者发现细菌来源的C—Sβ裂解酶能催化合成硫醇类物质[16,22-24]，其转化率普遍较低。Holt等[20]报道葡萄酒酿造过程中酿酒酵母V13来源的Str3p能够催化裂解半胱氨酸加合物（Cys-3MH，Cys-4MMP），生成12.3 μmol/L 4MMP和2.1 μmol/L 3MH，该酶在pH7.0时，4MMP的产量为pH 7.5时的47%。本研究中重组Str3p的糠硫醇产量在pH 8.0时较pH 7.0提高了近2.7 倍，说明偏碱性条件有利于催化反应的进行。

图9 不同pH值条件下糠硫醇产量Fig. 9 Production of 2-furfurylthiol at different pH levels

野生酿酒酵母G20中胱硫醚β-裂解酶经异源表达纯化，能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物生成糠硫醇，进一步明确Str3基因在糠硫醇合成代谢中的作用。多项研究认为，由半胱氨酸加合物（Cys-3MH和Cys-4MMP）生物转化生成3MH和4MMP的量很低（0.1%～10%）[2,19,25-26]。本研究发现在实验室模拟条件下硫醇类物质生物转化率（低于1%）明显低于真实发酵环境（最高达11%）。由于较低转化率和酵母菌对Cys-thiol的间接催化作用，很可能促使大量的前体物质被分解，并作为氮源、碳源或硫源等被机体所利用，这也与前期所发现的结论基本一致，在发酵或体外催化实验中，有大量糠醛、糠醇（糠醛被还原，仅在发酵体系下检测到）生成[12]。因此，对于糠硫醇生物合成分子机制，需要继续挖掘具有高效转化功能的酵母菌株，加强开发体系中这些未被利用的前体物质，以提升白酒及相关发酵食品特征风味。

3 结 论

通过基因工程技术构建高效表达Str3p的工程菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3），正交设计试验优化其蛋白诱导条件，并以半胱氨酸-糠醛加合物为底物，验证Str3p的催化作用。研究发现在诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导温度20 ℃、诱导时间13 h时，重组Str3p质量浓度为1.26 mg/mL，蛋白表达量和酶活力较优化前分别提高41.7%和38.6%；纯化后Str3p受反应pH值条件影响较大，在pH 8.0时，能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物（10 mmol/L）生成47 μmol/L糠硫醇。该研究结果将为天然硫醇类香料绿色制造、发酵食品特征风味形成提供理论支持和技术指导。