耐多药结核分枝杆菌对喹诺酮药物的耐药特性及分子机制的研究

石庆新 杨阳 蔡莺莺 周铁丽

结核病是由结核分枝杆菌引起严重危害人类健康的传染病。全球大约有1/3人口潜伏感染，其中5%～10%发展为结核病患者[1]。近年来，由于流动人口的增加、不规范治疗、患者依从性低等原因导致耐多药肺结核发生，也是结核病疫情上升的主要原因[2]。因此，预防和治疗耐多药肺结核成为结核病防治的关键。喹诺酮类药物作为抗肺结核的二线药物[3]，在耐多药肺结核患者和（或）不能耐受一线抗结核药物的肺结核患者治疗中起非常重要作用。该类抗菌药物具有抗菌谱广、口服吸收好、价格低廉等优点，被广泛应用于各种感染性疾病治疗。由于喹诺酮药物滥用，结核分枝杆菌对该药物敏感性呈逐年下降趋势，影响结核病患者的疗效。本课题通过开展耐多药结核分枝杆菌（MDRTB）对喹诺酮类药物体外药敏实验和喹诺酮类药物耐药基因突变位点的检测研究，了解MDRTB对喹诺酮类药物耐药特点及分子机制，为探索新一代氟喹诺酮类药物如莫西沙星、加替沙星等治疗MDRTB提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 选择2016年1月至2018年3月台州各县市区临床分离80株非重复MDRTB[温岭市第一人民医院16株、临海市第一人民医院10株、台州市第一人民医院11株、台州市立医院8株、台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院8株、玉环市第一人民医院9株、天台县人民医院5株、三门县人民医院7株、仙居县人民医院6株]。纳入标准：从台州各县市区诊断肺结核患者的痰标本中分离出利福平和异烟肼同时耐药的结核分枝杆菌。根据对氧氟沙星的敏感性分为两组：氧氟沙星耐药结核分枝杆菌（RMDRTB）组40株和氧氟沙星敏感结核分枝杆菌（SMDRTB）组40株。

1.2 试剂与仪器 氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星（中国上海源叶生物技术有限公司）；细菌DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、Extractor 36DNA提取仪（中国成都博奥生物有限公司）；Bio-Rad T100TMThermal Cycler PCR（美国 Bio-Rad公司）；细菌分散仪（中国广东体必康生物科技有限公司）；质控菌株结核分枝杆菌H37Rv（ATCC27924）（中国药品生物制品检定所）。

1.3 微量孔Alamar Blue显色法检测最小抑菌浓度（MIC） 参照文献[4]进行，在无菌分离管中加入0.9%氯化钠溶液1.5ml，加入3～4周鲜培养物，把无菌分离管插入细菌分散仪分散，配成1.0MCF的菌悬液，约为3×107CFU/ml浓度菌液。用7H9肉汤将配制好的菌悬液稀释25倍。在96孔微量无菌平板中，从A～H列的1～12孔中加入7H9肉汤溶液100μl，先分别把氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星粉剂配制成1 000 μg/ml药物原液，然后稀释到32μg/ml药液，再把浓度为 32μg/ml药液100μl加入第1孔，混匀后取出100μl，加入第2孔，同样连续2倍稀释至第10孔，第11孔为无药物阳性对照孔，第12孔为无菌阴性对照孔。从A～H列的1～11孔加入菌悬液100μl。用封板膜密封，放入37℃孵育箱，第6天加入30μl无菌0.1g/L刃天青溶液，37℃孵育24h。如果第11孔呈粉红色，则在其他各孔中加显色液，37℃孵育24h，记录观察结果；如果第11孔为蓝色，在第9和11天继续观察。蓝色不变色孔的药物浓度为菌株的MIC值。根据参考文献[5-6]，氧氟沙星、左旋氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星对结核分枝杆菌的MIC 判 断 折 点 分 别 为 2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml 和0.5μg/ml，4种药物对结核分枝杆菌MIC值分别大于各自MIC判断折点为耐药，4种药物对结核分枝杆菌MIC值分别小于等于各自MIC判断折点为敏感。

1.4 引物设计 参照文献[7]设计引物，gyrA基因上游引物为 5′-CCGGATCGAACCGGTTGACAT-3′，下游引物5′-GGGCTTCGGTGTACCTCAT-3′，扩增gyrA基因耐药决定区片段长度为358bp；gyrB基因上游引物为5′-AACACCGAGGTCAAATGGTT-3′，5′-CTGAATGCCGTCTTC CTTGTTGT-3′，扩增gyrB基因耐药决定区片段长度为695bp。引物由上海铂尚生物科技有限公司合成。

1.5 核酸提取 先加入80μl DNA提取液于提取管，加入20μl上述的菌悬液，放入Extractor36 DNA提取仪，振荡 10min，95℃金属浴 15min，12 000 r/min离心1min。

1.6 基因扩增 PCR的反应体系为30μl：包括rTaq 0.15μl，dNTP 0.5μl，PCR buffer 2.5μl，引物 2μl，模板 1μl，双蒸水23.85μl。放入Bio-Rad T100TMThermal Cycler PCR仪中进行扩增。扩增实验的条件：预变性94℃5min；变性95℃ 30s、退火55℃ 30s、延伸72℃ 2min进行35个循环；终延伸72℃10min。

1.7 序列测定 PCR产物送上海铂尚生物科技有限公司测序。

1.8 统计学处理 采用Whonet5.6统计软件分析结核分枝杆菌对喹诺酮类药物的敏感性和MIC50数据；采用Alignment软件对标准菌株和临床菌株测序结果进行比对分析。

2 结果

2.1 喹诺酮类药物对结核分枝杆菌的MIC SMDRTB组结核分枝杆菌对氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的敏感率均为100%。RMDRTB组结核分枝杆菌对氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星敏感性分别为0%、30.0%、42.5%和40.0%。氧氟沙星低浓度（MIC≤4μg/ml）耐药RMDRTB组结核分枝杆菌对左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星敏感率分别为46.7%、80.0%和73.3%。两组结核分枝杆菌对4种喹诺酮类药物的敏感率和MIC分布见表1。

2.2 耐多药结核分枝杆菌gyr基因的序列分析MDRTB通过测序与标准菌株H37Rv序列进行比对，在RMDRTB组中发现有33株gyrA基因发生突变，突变率为 82.5%，gyrA基因 Ala90Val突变 7株，Ser91Pro突变8株，Asp94Gly突变 12株，Asp94His突变 2株，Asp94Asn突变2株，Asp94Ala突变2株；发现有2株gyrB基因发生突变，突变率为5%，这2株gyrB基因株均与gyrA基因同时发生突变，突变类型为Thr478Asn+Asp94Gly和Asn477Thr+Asp94Gly；在SMDRTB组未发现gyr基因发生突变。gyrA基因部分位点的突变测序结果图见图1。氧氟沙星与左旋氧氟沙星耐药菌株检测到Ala90Val、Asp94Ala、Asp94His等 7 种gyr基因突变类型；莫西沙星和加替沙星耐药菌株检测到5种gyr基因突变类型。

表1 80株MDRTB对喹诺酮类药物的MIC

图1 结核分枝杆菌质控菌株H37Rv与临床菌株的gyrA基因的测序比对[a：质控菌株（H37Rv）部分gyrA基因测序图；b：临床菌株gyrA基因Ala90Val（GCG→GTG）突变测序图；c：临床菌株gyrA基因 Ser91Pro（TCG→GTG）突变测序图；d：临床菌株gyrA基因Asp94Gly（GAC→GGC）突变测序图]

2.3 40株RMDRTBgyr基因突变类型和氧氟沙星的MIC分布gyrA基因Ala90Val、Asp94Ala及Asp94His突变菌株氧氟沙星的 MIC 范围 4～8μg/ml，MIC50为 4μg/ml。gyrA基因Ser91Pro突变菌株氧氟沙星的MIC范围4～16μg/ml，MIC50为 8μg/ml。gyrA基因 Asp94Asn 突变菌株氧氟沙星的 MIC 范围 8～16μg/ml，MIC50为 8μg/ml。gyrB基因与gyrA基因同时发生突变2株菌氧氟沙星的 MIC 为 16μg/ml，MIC50为 16μg/ml。未发生突变的RMDRTB 菌株氧氟沙星的 MIC 范围 4～16μg/ml，MIC50为4μg/ml。40株RMDRTBgyr基因突变类型和氧氟沙星的MIC分布见表2。

3 讨论

近年来，在治疗结核分枝杆菌感染过程中出现了对三代氟喹诺酮药物类耐药的现象。据报道，各地区结核分枝杆菌对喹诺酮类药物存在不同程度的耐药[8]。本研究通过检测喹诺酮类药物对MDRTB的MIC值，发现氧氟沙星低浓度耐药的MDRTB对莫西沙星和加替沙星敏感性高于左氧氟沙星，与国内外报道一致[9-10]。提示氧氟沙星与左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星存在一定程度的交叉耐药。莫西沙星和加替沙星所显示出更好抗菌活性是因为其结构中甲氧基取代C-8位上的氢原子，莫西沙星还具有较低的防突变浓度[11]。根据文献报道，莫西沙星和加替沙星与一线药物联合使用在治疗复发和耐多药的结核患者具有良好的效果[12]。体内外的研究表明莫西沙星对氧氟沙星低浓度耐药MDRTB和SMDRTB有很好的杀菌作用，莫西沙星可以作为治疗氧氟沙星低水平耐药的耐多药肺结核患者推荐药物。

氟喹诺酮类抗菌药物作用于结核分枝杆菌的靶位是DNA旋转酶（Ⅱ型拓扑异构酶），主要是通过阻止DNA的复制导致死亡。DNA旋转酶是由gyrA基因编码的两个A亚基和gyrB基因编码的两个B亚基组成的四聚体。结核分枝杆菌对喹诺酮类药物产生耐药的主要分子机制是gyr基因中喹诺酮耐药决定区发生突变。本研究检到gyrA基因突变率为82.5%，与文献报道接近[13]。结核分枝杆菌gyrA耐药决定区突变类型存在于88-94位密码子，其中最常见是94位密码子Asp，Asp可被Gly、Asn、Ala、His和 Tyr等 5种氨基酸替换[8]。在本实验中检测到gyrA94位密码子Asp被前面4种氨基酸取代突变类型。实验中还检到2株RMDRTB发生gyrB基因突变，gyrB的基因突变比gryA基因突变发生率低得多，与国内外的文献报道一致[5，9，12]。相关研究表明gyrB突变使氟喹诺酮耐药表型的检出率提高了12%[14]。虽然结核分枝杆菌gyrB基因的突变率很低，但与喹诺酮类药物耐药也密切相关，也不能忽略。

表2 40株RMDRTB gyr基因突变类型和氧氟沙星的MIC分布

本研究数据表明：RMDRTB的gyrA基因Ser91Pro和Asp94Asn位密码子的突变与喹诺酮类药物高水平耐药相关；gyrA基因 Ala90Val、Asp94His和 Asp94Ala位密码子的突变与喹诺酮类药物低水平耐药相关，与文献报道一致[15]。RMDRTB在gyrA和gyrB基因同时发生突变比gyrA基因单独突变时的氧氟沙星抑菌浓度上升2～4倍，提示两个基因同时突变可能与喹诺酮类药物高水平耐药相关，与文献研究结果一致[10]。gyr不同突变位点与耐药水平相关，可能是由于基因位点突变后转录翻译成蛋白结构发生改变，影响喹诺酮类药物与DNA解旋酶结合的稳定程度，影响耐药水平。在分子检测过程中考虑gyr基因突变组合可以提高预测氟喹诺酮耐药表型的准确性。本研究有7株RMDRTB的gyrA和gyrB基因耐药决定区未检测到突变位点，突变位点可能发生在筛选的耐药决定区域之外的突变的gyr基因和在其它基因上，如MFPA（Rv3361c），或主动外排泵RV2686c-Rv2687c-Rv2688c操纵子，与喹诺酮类药物耐药相关[13]。其MIC50为4μg/ml，可能与喹诺酮类药物低水平耐药相关，由于检测数量少和突变位点未检测，需要增加标本数量和进一步研究确定其他相关的分子耐药机制。

综上所述，莫西沙星在体外对氧氟沙星低浓度耐药MDRTB和SMDRTB活性高于氧氟沙星、左旋氧氟沙星、加替沙星喹诺酮药物，gyr基因突变对莫西沙星敏感性的影响小于左旋氧氟沙星和加替沙星，莫西沙星可以作为临床治疗氧氟沙星低水平耐药的MDRTB患者首选药物。